小麦WRKY转录因子TaWRKY72B的克隆、亚细胞定位及表达分析

WRKY蛋白是一类转录因子,参与调控植物的多种生长发育和胁迫应答过程。为进一步探究WRKY在小麦响应逆境中的作用,本研究克隆了小麦中国春的TaWRKY72B基因,并对其进行了生物信息学、亚细胞定位和表达模式分析。结果表明,中国春的TaWRKY72B基因编码320个氨基酸,蛋白序列包含典型的WRKY保守结构域和C2H2锌指结构,分子量为33.94 kDa,理论等电点为6.60,是酸性亲水的不稳定蛋白,无信号肽序列,属非跨膜蛋白。二级结构预测表明,TaWRKY72B主要由无规则卷曲(61.25%)、α-螺旋(23.12%)、延伸链(11.88%)和β-转角(3.75%)组成。TaWRKY72B定位于细胞核,符合转录因子特征。系统进化树分析显示,TaWRKY72B蛋白与节节麦、大麦和水稻等禾本科作物的WRKY亲缘关系较近。启动子顺式作用元件预测结果表明,该基因含有多个与生长发育、激素信号途径以及非生物胁迫应答相关的顺式调控元件。TaWRKY72B表达受激素、高温、低温和盐诱导,推测该基因可能参与小麦逆境胁迫应答和多种激素信号途径。

津藜系列藜麦芽苗期耐盐碱特性评价

为了综合评价津藜系列品种的耐混合盐碱特性进而筛选耐盐碱性较好的品系,用于藜麦新品种选育,以津藜系列7个藜麦品种为供试材料,在T4(NaCl∶Na_(2)SO_(4)∶NaHCO_(3)∶Na_(2)CO_(3)=1∶9∶9∶1)、T5(NaCl∶Na_(2)SO_(4)∶NaHCO_(3)∶Na_(2)CO_(3)=1∶1∶1∶1)、T6(NaCl∶Na_(2)SO_(4)∶NaHCO_(3)∶Na_(2)CO_(3)=9∶1∶1∶9)3种不同混合盐碱胁迫处理下,测定了藜麦种子的发芽率、胚根长和幼芽鲜质量,并利用耐盐碱系数和隶属函数值对7个藜麦品种进行耐盐碱特性评价。结果表明:不同混合盐碱胁迫对藜麦种子发芽率的影响不是很大,但是对藜麦种子的胚根长以及幼芽鲜质量有较强的抑制作用。将以上述各指标的耐盐碱系数及其隶属函数值作为衡量藜麦种子耐盐碱性的依据,分析发现‘津藜1号’耐盐碱性较强,‘津藜5号’耐盐碱性较弱。

保卫细胞表达调控启动子研究进展

保卫细胞是研究植物逆境胁迫和生物学功能的重要细胞模型。通过筛选和设计保卫细胞高表达调控启动子,可以实现下游抗逆基因在保卫细胞的有效表达,为转基因分子育种提供理论基础和优异基因资源。本研究概述了近30年来发现的保卫细胞专一性表达、优势表达、发育谱系细胞表达和嵌合型表达启动子的研究进展,以及[T/A]AAAG顺式作用元件在启动子区中的相对位置与特异性表达的关系。此外还指出了保卫细胞特异性启动子研究目前存在的问题,并对未来发展方向提出了展望。

植物单细胞分离与转录组学分析研究进展

细胞异质性是多细胞生物体中普遍存在的现象。通过分离单细胞,并对其进行转录组分析,有助于准确而深入地理解细胞分化、信号转导等生物学过程及相关的基因调控网络。目前动物细胞的相关研究已取得显著进展,而植物由于存在细胞壁,显著增加了细胞分离的难度及基因表达数据的准确度,限制了植物单细胞转录组测序的研究进展。本研究综述了几种有较广阔应用前景的植物单细胞分离技术,重点介绍了根细胞和保卫细胞两类典型细胞的单细胞转录组学研究进展,并讨论了植物单细胞转录组学研究中存在的问题及未来展望。

两种不同的原核表达载体蛋白表达及纯化的比较

为了比较两种不同的原核表达载体体外表达纯化CP05-GFP蛋白的能力,本研究通过构建pET28b-CP05-GFP(双His-Tag)、pET28b-CP05-GFP(单His-Tag)、pGEX-6p-1-CP05-GFP(GST-Tag)三个原核表达质粒,诱导表达并纯化带有不同标签的CP05-GFP蛋白。通过考马斯亮蓝染色技术比较两种不同的原核表达载体表达以及体外纯化CP05-GFP蛋白的能力,发现3个原核表达载体均能诱导表达出CP05-GFP蛋白,且能纯化出CP05-GFP蛋白,但是不同标签纯化CP05-GFP蛋白的纯化效率是不同的:pET28b-CP05-GFP(双His-Tag)原核表达系统能够表达并纯化出CP05-GFP蛋白,但其表达量低易纯化;pET28b-CP05-GFP(单His-Tag)原核表达系统能够表达并纯化出CP05-GFP蛋白,其表达量高但不易纯化;pGEX-6p-1-CP05-GFP(GST-Tag)原核表达系统可表达出足量的CP05-GFP(GST-Tag)蛋白,并且易纯化。本研究有助于选择合适的载体进行融合蛋白的表达和纯化。

植物钙依赖蛋白激酶的结构、表达特性及其生物学功能

钙离子(Ca^(2+))是植物信号转导途径的主要信号组分之一,钙依赖蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase,CDPK)是Ca2+的信号传感器。当植物感受到自身或外界信号刺激后,细胞中的钙信号经CDPK传递到下游,导致基因表达变化并引发级联反应和一系列生理响应过程。本研究综述了CDPK的结构特征和表达特性,重点介绍了其在植物发育、逆境胁迫应答、气孔运动和激素信号转导等方面的生物学功能,指出CDPK在植物信号转导和应答环境变化过程中的重要作用,并对未来CDPK的研究前景进行了展望,旨在为深入研究CDPK的功能和调控机制提供参考。

酿酒酵母起始密码子表达载体pYES2-ATG的构建及应用

鉴定合成的或通过高通量随机组合方法获得的潜在功能片段的生物学功能需要一套高效便捷的酵母表达专用载体。酵母表达载体pYES2多克隆位点处不含起始密码子,通过设计含有ATG和EcoRⅠ酶切位点的特异性引物扩增一段Intron,利用In-Fusion重组技术(Clontech)将该片段构建至酵母表达载体pYES2,得到一个含有ATG的重组酵母表达载体pYES2-ATG。为了检测该载体的功能,扩增不含起始密码子的DNA序列nlea,该序列由本实验室设计合成,具有潜在的耐盐功能。构建重组表达载体pYES2-ATG-nlea在酵母中进行功能鉴定。研究结果表明,半乳糖诱导后,含pYES2-ATG-nlea的重组酵母菌株耐盐能力明显高于含pYES2-ATG空质粒的菌株,表明在该载体系统上的添加了起始密码子的nlea成功表达,具有一定的耐盐性,同时也证明改造的载体系统可用于没有起始密码子的编码区序列的功能筛选和鉴定。pYES2-ATG酵母载体系统不影响原始载体基本功能元件的表达,同时能使不含起始密码子编码区序列在酵母中正常表达,在大规模进行多个基因的功能鉴定中具有重要的应用价值。

亲水短肽基因NLEAs提高酵母的耐盐能力

胚胎晚期富集蛋白(late embriogenesis abundant protein,LEA)是植物种子成熟过程中富集的蛋白质,与植物应答逆境胁迫密切相关,具有很强的亲水性。LEA蛋白的增多,有利于降低细胞水势,增强植物耐盐胁迫等逆境的能力。为了进一步提高LEA蛋白的亲水性,提高细胞耐受盐胁迫等渗透胁迫的能力,本研究对LEA蛋白数据库进行了生物信息学分析。结果鉴定出一系列亲水性高的氨基酸序列。对这些序列进行重复及随机组合后,合成了假定的NLEA(Novel LEA)基因。通过筛选转基因酵母菌株,获得了有助于提高酵母耐盐性的NLEA8和NLEA13基因。同时,初步分析了NLEA8和NLEA13基因表达的蛋白的与植物耐盐相关的生物学功能和结构特点。本试验获得了LEA基因,通过酵母耐盐性筛选验证其耐盐能力,对耐盐基因的获得及验证提供了一定的参考。

人工合成耐盐基因NLEAs提高拟南芥的耐盐性

盐害是影响农业生产的非生物胁迫之一。植物中的胚胎晚期富集蛋白(LEA)是在逆境中发挥作用的一类生物活性分子。通过对模式植物拟南芥中的LEA蛋白家族进行生物信息学分析,利用生物合成学手段,人工合成了具有亲水抗逆潜力的Novel LEA (NLEAs)。为了进一步验证人工合成的NLEAs基因在植物抵抗盐胁迫中的能力,本研究通过遗传转化将10个筛选出的人工合成亲水短肽基因在模式植物拟南芥中进行功能验证。对转基因拟南芥进行氯化钠胁迫实验,筛选出NLEA41、NLEA44、NLEA63和NLEA98这4个人工合成的NLEAs基因具有提高植物抵抗盐胁迫的能力。测定结果显示,这4个转基因阳性植株的过氧化氢(H2O2)含量、丙二醛(MDA)含量明显低于野生型植株,超氧化物歧化酶(SOD)活性明显高于野生型植株,确定了人工合成的NLEAs基因可以提高拟南芥的抗氧化能力,从而提高了转基因拟南芥的耐盐性。本研究为新型强耐盐基因的获得与应用提供了新的思路,丰富了耐盐基因资源。

酵母高效克隆表达T载体pYES2-T的构建及应用

为了在酵母中高通量、高效率地对外源基因进行克隆和表达,本研究以酵母表达载体pYES2为基础,构建高效克隆表达T载体。pYES2是酿酒酵母的一种高效表达载体,在其多克隆位点处设计插入XcmⅠ-Intron-XcmⅠ片段,同时将其载体中URA3基因中原有的XcmⅠ酶切位点进行定点突变,构建出pYES2-T酿酒酵母高效表达T载体。利用XcmⅠ酶切载体pYES2-T,使其产生两个突出的T末端,一方面可以通过PCR产物加A的方式直接进行TA克隆;另一方面可在半乳糖诱导启动子的调控下,对TA克隆后的外源基因在酵母中诱导表达。利用该系统高通量地对人工合成耐盐系列基因NLEAs进行筛选,研究结果表明,该系统可以在酿酒酵母中一步式完成片段克隆及耐盐基因的筛选。本研究构建的酵母表达T载体使用方便、效率高、成本低,应用前景广阔。