双孢蘑菇采后不同组织部位植物激素的产生规律

以双孢蘑菇为试验材料,探究在20℃贮藏条件下双孢蘑菇子实体不同组织部位中脱落酸(ABA)、赤霉素(GA)、生长素(IAA)和玉米素核苷(ZR)含量的变化。结果表明,GA与IAA含量在双孢蘑菇采后贮藏中的变化规律相似,可能协同调控子实体的采后膨大、破膜开伞以及后期孢子的产生过程。ABA和GA在菌柄组织采后的衰老过程中作用突出。ABA可能启动并参与双孢蘑菇采后衰老的过程。与ABA、GA、IAA相比较,ZR分布的组织差异性更显著,可能与采后菌褶的增厚和孢子的形成密切相联。以上结果表明,这4种激素在双孢蘑菇采后贮藏中呈现组织差异性规律,并与双孢蘑菇继续发育和衰老过程有关。本研究结果为寻找有效控制双孢蘑菇采后品质下降提供一定的理论基础。

莱茵衣藻纤毛内运送蛋白IFT57抗原的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

IFT57是纤毛内运送蛋白IFT B复合物的一个重要组分,在鞭毛组装中发挥着重要作用。利用莱茵衣藻ift57基因中一段编码亲水性氨基酸序列的片段构建了带有6×His标签的原核表达载体pET-28a(+)-ift57,并转入大肠杆菌BL21(DE3),通过IPTG诱导表达蛋白质,以12 g/dL SDS-PAGE鉴定,获得相对分子质量大小为17200的ITF57重组蛋白质片段。对6×His-IFT57融合蛋白质进行纯化,并用其免疫新西兰大白兔,采集第5次免疫后血液并分离血清。利用Western blotting对所获抗体进行特异性鉴定。ELISA测定结果表明,抗血清效价为512000。在抗血清经Protein A纯化后,Western blotting检测显示所制备的IFT57多克隆抗体能够特异性识别莱茵衣藻中的IFT57蛋白质。这一结果表明,为表达纯化溶解性较差的蛋白质抗体制备提供了借鉴意义,所获抗体为深入研究IFT57在鞭毛组装中的作用机理奠定了基础。

粗糙脉孢菌ERG-11蛋白抗原的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备

构建p ET-28a(+)-ERG-11重组质粒,表达6×His-ERG-11融合蛋白,制备ERG-11多克隆抗体。采用PCR技术扩增目的片段,插入p ET-28a(+)原核表达载体,并转入E.coli BL21(DE3)感受态表达融合蛋白,融合蛋白经亲和纯化及分子筛纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,取血清后,采用间接ELISA法和Western blot法检测多克隆抗体的效价及特异性。成功构建了p ET-28a(+)-ERG-11表达载体,SDS-PAGE电泳显示成功诱导出以包涵体形式存在的6×His-ERG-11融合蛋白,两步纯化后得到纯度较高的抗原,间接ELISA法显示制备的多克隆抗体效价达到1∶512 000,Western blot显示具有较高特异性。成功实现了粗超脉孢菌ERG-11蛋白的原核表达,制备出一支兔抗粗超脉孢菌ERG-11的多克隆抗体。

苜蓿中华根瘤菌烯酯酰ACP还原酶FABI2的原核表达纯化以及多克隆抗体的制备

烯酯酰ACP还原酶基因fab I是脂肪酸合成途径中的关键基因,苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)基因组中有这一基因的同源基因fab I1和fab I2,为了对中华苜蓿根瘤菌烯酯酰ACP还原酶基因fab I2的功能进行深入研究,本实验进行该基因多克隆抗体的制备.从已有的pET-28b-FABI2质粒中扩增出目的片段,构建了带有GST标签的原核表达载体p GEX-2T-FABI2,将两个标签的表达载体转入大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)后,在0.1,mmol/L IPTG、20,℃、185,r/min条件下诱导6,h,分别获得相对分子质量约为2.8×104、5.4×104表达fab I2的重组蛋白,且均在上清液中以可溶性蛋白的形式存在.将经Ni柱亲和纯化的6×His-FABI2融合蛋白免疫新西兰大白兔,4次免疫后测效价达256,000.进一步将抗血清经过ProteinA纯化获得了高特异性和灵敏度的多克隆抗体.以得到的抗体为一抗,另一个标签的抗原上样进行免疫印迹(Westernblot)检测,为单一条带,说明制备的多克隆抗体能够很好地识别FABI2蛋白,并且排除了标签所产生的抗体对Western blot结果的影响.

莱茵衣藻IFT22蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

纤毛内运输蛋白IFT22是IFT复合物B中(IFT-B)的一个重要组分,但对其功能研究存在很大的争议,为深入研究IFT22功能,制备一支特异性好的IFT22抗体是必不可少的。该研究首先用纯度为93%的6×His标签IFT22抗原免疫新西兰大白兔,采集3次免疫后血清,间接ELISA法测定效价为1?64 000。抗血清经Protein A和抗原抗体纯化后, Western blot检测结果表明,以Chlamydomonas reinhardtii CC125全细胞为抗原时,孵育IFT22抗体后,只有一条带出现,说明anti-IFT22特异性非常好,是研究IFT22蛋白功能的绝佳材料。

莱茵衣藻LZTFL1蛋白的多克隆抗体制备及应用

目的:亮氨酸拉链转录因子1(LZTFL1)是一种与纤毛信号转导相关的蛋白质,关于其如何在信号转导中发挥作用以及作用机制目前尚不清楚。莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是研究纤毛信号传导的模式生物,而目前对莱茵衣藻LZTFL1蛋白的研究甚少,尚未有相应的检测抗体,因此制备LZTFL1多克隆抗体用于后续实验研究。方法:采用RT-PCR技术从C.reinhardtii CC125中提取总RNA,扩增981bp的目的基因Lztfl1,插入到p ET-28a(+)原核表达载体,成功构建p ET-28a(+)-Lztfl1重组质粒,转入E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导后成功表达6×His-LZTFL1融合蛋白,融合蛋白经亲和纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,最后采用间接ELISA法测得抗血清效价达到1∶512 000,经Western blot对C.reinhardtii CC125检测具有较高特异性。结果:首次实现了莱茵衣藻LZTFL1蛋白的原核表达,制备出一支兔抗莱茵衣藻LZTFL1蛋白的多克隆抗体,为后续研究LZTFL1蛋白在莱茵衣藻中的结构功能及在纤毛信号转导中的相互作用奠定了基础。

小G蛋白BBS3b的原核表达纯化及其多克隆抗体制备

[目的]制备莱茵衣藻小G蛋白BBS3b的多克隆抗体。[方法]利用莱茵衣藻bbs3b基因的c DNA序列分别构建了带有GST和6×His标签的原核表达载体p GEX-2T-BBS3b和p ET-28a(+)-BBS3b并转化至大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达,以12%SDS-PAGE鉴定。用纯化的GST-BBS3b融合蛋白免疫新西兰大白兔,采集第4次免疫后血液并分离血清,利用间接ELISA法进行效价测定,并将抗血清依次经过Protein A纯化和硝酸纤维素膜纯化,用Western Blotting检测抗体特异性。[结果]GST-BBS3b和6×His-BBS3b融合蛋白的分子量分别为46、20 k Da。用ELISA的方法测定抗血清效价为512 000,Western Blotting检测结果显示制备的多克隆抗体能够特异性识别莱茵衣藻BBS3b蛋白。[结论]制备的多克隆抗体效价为512 000,能够特异性识别莱茵衣藻中BBS3b蛋白,为利用莱茵衣藻作为模式生物进行BBS3b在纤毛信号传导中的作用机理研究奠定了基础。