PCR-HRM分析筛查成骨不全一家系患儿基因突变

目的采用PCR-高分辨率熔解曲线(HRM)分析筛查成骨不全(OI)一家系患儿(先证者)COL1A1基因突变位点,探讨其基因型与临床表型的联系。方法对先证者进行家族史及临床资料的调查,采集先证者、家属及50名正常对照者血液标本,应用PCR-HRM分析筛查先证者及正常对照者COL1A1基因突变,基因测序确证突变位点。结果先证者COL1A1基因17外显子筛查结果异常,其熔解温度(Tm)值比正常对照者Tm值低约0.4℃。先证者与正常对照者的标准熔解曲线及差异熔解曲线均有明显差异。测序结果为c.1138G>A,突变导致380位氨基酸由甘氨酸(Gly)变成丝氨酸(Ser):p.(Gly 380 Ser),为错义突变。先证者父亲、祖母均具有相同突变位点。先证者母亲及正常对照者基因测序结果无此突变。该突变在中国人群中未见报道。该家系遗传特征为常染色体显性遗传,先证者临床诊断为Ⅳ型OI,临床表型较严重。结论 PCR-HRM分析是有效的OI基因筛查新方法。COL1A1基因c.1138G>A突变在中国人群中为新发现的突变位点。α螺旋结构域Gly被替换可能导致较严重的临床表型。

多重引物HRMA对成骨不全患者COL1A1/2基因突变的筛查与分析

目的建立多重引物高分辨熔解曲线分析(high resolution melting analysis,HRMA)方法并运用该方法筛查两例成骨不全(osteogenesis imperfecta,OI)COL1A1/2的突变基因。方法收集两例OI患者临床资料,采集患者及50例正常对照的血液标本。设计COL1A1、COL1A2基因103个外显子所对应的引物,将满足一定条件的两对引物相互配对,与单份样本DNA混合作为扩增体系。运用HRMA筛查产物突变情况,基因测序确定突变位点。结果本研究中共涉及到COL1A1和COL1A2的103个外显子,其中成功配对39对,未配对成功的有3个COL1A1外显子和22个COL1A2外显子,成功率为75.73%。先证者1筛查结果HRMA熔解曲线在COL1A141号外显子上存在异常,测序结果为c.2877delT杂合突变,即cDNA2877位碱基T缺失,编码的缬氨酸变成色氨酸。先证者2筛查结果HRMA熔解曲线在COL1A116号外显子上存在异常,测序结果为c.1028delC杂合突变,即cDNA1028位碱基C缺失,编码的脯氨酸变成亮氨酸。两种突变类型在中国人群中均未见报道,为新发现的两种剪切突变,且与传统HRMA筛查结果一致。结论多重引物HRMA方法在传统HRMA基础上进行了创新,将两对引物与单份样本DNA混合作为扩增体系,HRMA筛查产物突变情况,且与传统HRMA筛查结果一致,具有一定创新性和可行性,为成骨不全患者基因突变及其他遗传病致病基因的筛查提供了新的思路。

高分辨率熔解曲线分析在成骨不全相关基因突变筛查中的应用

目的探讨高分辨率熔解曲线分析（HRMA）在成骨不全（OI）相关基因突变筛查中的应用价值。方法收集2012年3月至12月于天津医院住院的5例0I患儿临床资料。采集患儿、有家族史患儿父母及查体健康者（正常对照）血液标本，PCR—HRMA筛查患儿COL1A1／COL1A2基因所有外显子及其侧翼序列，基因测序确定突变位点。有家族史患儿父母基因测序进行验证。结果PCR-HRMA显示，5例患儿分别在COL1A1基因11、39、8外显子及COL1A2基因19外显子区域结果异常，患儿熔解曲线与正常对照比较存在差异，提示患儿基因变异，标准熔解曲线显示患儿基因型均为杂合子。5例患儿基因测序结果分别为COL1A1基因c．768dupC、C．2644c〉T、C．635G〉A以及COL1A2基因c．982G〉A、C．948C〉T。患儿1、2基因突变导致提前形成终止密码子，临床诊断均为Ⅰ型OI。患儿3、4基因突变均使α螺旋结构域甘氨酸（Gly）被替代，临床诊断为Ⅳ型OI。患儿5基因变异未造成氨基酸的改变，该变异不是导致0I的原因，可能的致病原因有待研究。结论PCR—HRMA因具有成本低、操作简便快速、高通量、无污染等优势，成为0I基因筛查有效的新方法。COL1A1基因突变C．768dupC为新发现的突变位点。

成骨不全家系患者相关基因突变筛查及分析

目的筛查4例成骨不全（0I）家系先证者I型前胶原α链基因（COL1A1／COLIA2）基因突变，分析基因型与表型的关系。方法收集先证者及家系成员临床资料，采集先证者、家系成员及50例正常对照的血液标本。采用聚合酶链反应（PCR）．高分辨率熔解曲线分析（HRMA）筛查先证者COL1A1／COL1A2基因突变，基因测序确定突变位点。结果HRMA显示先证者1分别在COL1A2基因12外显子、19外显子区域结果异常，标准熔解曲线与正常对照存在明显差异。测序结果，先证者1分别在COL1A2基因12外显子、19外显子及18内含子发生突变：c．578G〉T、c．948C〉T、c．937-3T〉C；其中c．948C〉T、c．937-3T〉C为单核苷酸多态性（SNP）位点，c．578G〉T为新发现的突变位点。先证者2、3、4，分别在COL1A2基因的38外显子、COL1A1基因的6外显子、23外显子区域的标准熔解曲线与正常对照存在明显差异。测序验证先证者2COL1A2基因突变：c．2305G〉T。先证者3、4均在COLlAl基因发生突变：C．517G〉T、c．1588G〉A。其中先证者3COL1A1基因c．517G〉T为新发现的突变位点。先证者1、2．4基因突变，导致I型胶原蛋白3股螺旋区域甘氨酸（Gly）被替换，可引起较为严重的表型，先证者3的无义突变，可造成I型胶原合成量的改变，临床表型较轻。结论患者COL1A2基因c．578G〉T、COL1A1基因c．517G〉T均为新发现的突变位点，患者的基因型与临床表型存在一定的联系。

成骨不全患儿COL1A1基因第45外显子两个突变位点的筛查及分析

目的应用聚合酶链反应-高分辨率熔解曲线分析（polymease chain reaction-high-resolutionmelting analysis, PCR-HRMA）技术筛查成骨不全症（osteogenesis imperfecta, OI）患者COL1A1/COL1A2基因的突变，并探讨突变位点与疾病的关系。方法采集家系成员（患儿、患儿父母）以及50名正常对照的血液样本，应用PCR-HRMA技术筛查患儿家系及正常对照者的COL1A1／COLIA2基因突变，并用基因测序验证。应用蛋白预测软件PolyPhen、SIFT及AlignGVGD对两个杂合突变进行预测。结果该患儿及其父母COL1A1基因第45外显子区域的PCR-HRMA结果显示异常，标准熔解曲线和差异熔解曲线与正常对照比较均存在明显差异。测序结果显示，患儿COL1A1基因第45外显子区域发生两个杂合突变（c．3235G〉A、c．3247G〉A），临床诊断为Ⅳ型OI。c．3235G〉A来源于患有OI的父亲，使α螺旋结构域1079位氨基酸由甘氨酸（Gly）突变为丝氨酸（Ser）。c．3247G〉A来源于表型正常的母亲，使1083位氨基酸由丙氨酸（Ala）突变为苏氨酸（Thr）。50名正常对照均未发现这两种突变。3种蛋白预测软件PolyPhen、SIFT及AlignGVGD均预测c．3235G〉A突变可能影响蛋白的功能。而c．3247G〉A突变，PolyPhen软件预测其可能为良性。结论COL1A1基因第45外显子上同时存在c．3235G〉A、c．3247G〉A突变的病例在人类胶原突变数据库中未见报道。COL1A1基因c．3235G〉A突变可能是导致该患儿成骨不全的主要原因。