钠钾泵抑制剂通过调节细胞周期相关蛋白的生成介导肝癌HepG2细胞周期S期阻滞与凋亡

目的研究钠泵抑制剂哇巴因(ouabain)和华蟾毒配基(cinobufogenin)对人肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用及细胞周期的改变,初步分析其机制。方法以人肝癌细胞HepG2为靶细胞,MTT比色法检测哇巴因和华蟾毒配基对HepG2细胞增殖的影响;Hoechst 33342荧光染色检测细胞形态学变化;流式细胞术检测细胞周期;实时定量PCR和Western blot检测CyclinA1、CDK2、PCNA和p21CIP1表达的变化。结果哇巴因和华蟾毒配基可明显抑制HepG2细胞增殖,抑制作用呈时间-浓度依赖性。荧光染色显示药物处理24h后,细胞呈现典型的凋亡形态特征;细胞周期分析显示,实验组S期细胞比例升高,实时定量PCR和Western blot结果显示:哇巴因和华蟾毒配基可下调CyclinA1、CDK2和PC-NA的表达(P<0.05),上调p21CIP1的表达(P<0.05)。结论钠泵抑制剂可抑制肝癌HepG2细胞的增殖,引起细胞周期S期阻滞,诱导细胞凋亡,这与其调节细胞周期相关蛋白的生成关系密切。

哇巴因抑制钠泵β1亚单位和VE-cadherin减弱血管内皮细胞连接功能

目的探讨钠泵抑制剂哇巴因对血管内皮细胞连接的影响及机制。方法以人脐静脉内皮细胞(HUVECs)为靶细胞,Hoechst33342/PI双荧光染色法观察哇巴因作用后细胞凋亡或坏死特征,透射电镜和光镜观察细胞形态结构变化。应用半定量聚合酶链反应检测钠泵α1亚单位、β1亚单位、VE-cadherin和SnailmRNA的表达。结果0.1μmol.L-1哇巴因作用HUVECs24～48h,细胞死亡以凋亡为主,10μmol·L-1哇巴因作用24h,引起细胞坏死;对照组细胞间的细胞连接数量多,结构清晰,而经哇巴因作用后,细胞连接丧失,细胞脱落。哇巴因作用HUVECs后,钠泵α1亚单位和Snail表达上调,β1亚单位和VE-cadherin表达下降,其改变均呈剂量和时间依赖性。结论哇巴因通过下调血管内皮细胞钠泵β1亚单位和VE-cadherin的表达使细胞连接功能减弱。

哇巴因对血管内皮细胞ECV304细胞凋亡及胞内游离钙离子和活性氧浓度的影响

目的研究哇巴因(毒毛花苷G)对人脐静脉血管内皮细胞ECV304凋亡的诱导作用,并探讨其可能的作用机制。方法哇巴因0.01,0.05,0.1,0.5,1和10μmol·L-1与ECV304细胞作用24,48和72h,MTT法检测细胞存活率,Hoechst33342/碘化丙锭双荧光染色法和流式细胞仪检测细胞凋亡百分率,激光共聚焦显微镜观察细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)和活性氧(ROS)浓度,逆转录PCR和Western印迹法检测胱天蛋白酶3mRNA和蛋白表达。结果哇巴因在0.01～10μmol·L-1浓度范围内与ECV304细胞分别作用24,48和72h,对细胞存活的抑制率明显增加,且呈浓度和时间依赖性,24,48和72h浓度-效应相关系数分别为0.984,0.994和0.997(P<0.05);哇巴因作用24,48和72h的IC50值分别为0.624,0.184和0.041μmol·L-1,时间-效应相关系数为0.974(P<0.05)。哇巴因0.1μmol·L-1与ECV304细胞作用24h,细胞凋亡百分率由正常对照组的(4.2±0.5)%升高到(26.0±3.2)%,作用48h,细胞凋亡率由(4.7±0.5)%升高到(36.5±5.3)%,差异有统计学意义(n=3,P<0.01);同时细胞出现染色质凝集。哇巴因0.01,0.1和0.5μmol·L-1分别与ECV304细胞作用12,24和36h,[Ca2+]i和ROS浓度呈浓度和时间依赖性增加,在哇巴因0.5μmol·L-1时[Ca2+]i和ROS浓度的时间-效应相关系数分别为0.912和0.924,作用36h时[Ca2+]i和ROS浓度的浓度-效应相关系数分别为0.889和0.907(P<0.05)。逆转录PCR和Western印迹法分析显示,哇巴因0.1和0.5μmol·L-1作用ECV304细胞24h后,胱天蛋白酶3mRNA表达增加,差异有统计学意义(P<0.05);哇巴因0.01,0.1和0.5μmol·L-1作用ECV304细胞24h,胱天蛋白酶3蛋白表达明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论哇巴因可诱导人脐静脉血管内皮细胞ECV304凋亡,其机制可能与增加[Ca2+]i和ROS浓度及胱天蛋白酶3表达有关。

土槿乙酸抑制人卵巢癌SKOV_3细胞增殖并诱导G_2/M期阻滞

目的探讨土槿乙酸(pseudolaric acid B,PLAB)对人卵巢癌SKOV3细胞增殖和细胞周期的影响。方法 MTT法检测PLAB对细胞生长抑制作用;Hoechst 33342荧光染色分析细胞死亡特征;流式细胞术检测细胞周期;Real time-PCR和Western blot检测周期相关基因Cyclin B1、CDK1和CyclinD1的表达变化。结果 PLAB明显抑制SKOV3细胞生长,且抑制作用呈浓度-作用时间依赖性(P<0.05),其24、48和72 h的IC50值分别为2.44、1.60、2.94μmol.L-1。5μmol.L-1PLAB处理细胞24 h,细胞出现核染色质凝集、凋亡小体等典型凋亡特征,随着PLAB浓度升高,G2/M期细胞比例明显增大并表现出时间依赖性(P<0.05),同时伴有Cyclin B1和CDK1呈高表达状态(P<0.05),Cyclin D1呈低表达状态(P<0.05)。结论 PLAB可抑制SKOV3细胞生长,引起细胞G2/M期阻滞,伴随Cyclin B1和CDK1呈高表达状态,可能与其调控周期相关蛋白降解有关。

土槿乙酸诱导前列腺癌DU-145细胞周期阻滞的机制研究

目的:探讨土槿乙酸(pseudolaric acid B,PLAB)对人前列腺癌细胞株DU-145细胞增殖和细胞周期的影响。方法:MTT法检测PLAB对细胞生长抑制作用;Hoechst 33342荧光染色分析细胞死亡特征;流式细胞术检测细胞周期;Real-timePCR和Western blot检测周期相关基因cyclin B1,CDK1和cyclin D1的表达变化。结果:PLAB明显抑制DU-145细胞生长,且抑制作用呈浓度-作用时间依赖性(P<0.05),其24,48,72 h的IC50分别为4.53,2.39,2.08μmol·L-1。5μmol·L-1PLAB处理细胞24 h,细胞出现核染色质凝集、凋亡小体等典型凋亡特征,随着PLAB浓度升高,G2/M期细胞比例明显增大并表现出时间依赖性(P<0.05),同时伴有cyclin B1和CDK1呈高表达状态(P<0.05),cyclin D1呈低表达状态(P<0.05)。结论:PLAB可抑制DU-145细胞生长,引起细胞G2/M期阻滞,伴随cyclin B1和CDK1呈高表达状态,可能与其调控周期相关蛋白降解有关。

Na＋／K＋-ATP酶α1亚单位小干扰RNA和哇巴因诱导肝癌HepG2细胞S期阻滞及其机制

目的观察哇巴因联合Na＋／K＋-ATP酶（钠泵）011亚单位小干扰RNA（siRNA）对人肝癌HepG2细胞增殖和细胞周期的影响。方法分析人肝癌临床组织标本、正常肝组织和肝癌细胞系SMC7721、Bel7402和HepG2细胞钠泵α1亚单位的表达。CCK-8法检测采用钠泵0L1亚单位siRNA和哇巴因作用肝癌HepG2细胞增殖抑制状况，分析各组细胞的钠泵活性变化，流式细胞术分析细胞周期变化。实时定量PCR和蛋白质印迹法检测钠泵仅1、促分裂源活化蛋白激酶1（MAPK1）、细胞围期蛋白1（CyclinA）、周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）、增殖细胞核抗原（PCNA）和细胞周期蛋白抑制因子（P21WAFI）表达的变化。结果肝癌组织标本的钠泵α1亚单位密度值（174．7±16．8）明显高于正常肝组织（65．3±7．9，P〈0．05）；HepG2细胞钠泵α1亚单位表达明显高SMMC-7721和Bel-7402细胞（P〈0．05）。siRNA、哇巴因和联合用药可抑制HepG2细胞的增殖，联合实验组效果更显著（P〈0．05），0．03μmol／LsiRNA组、0．1μmol／L哇巴因和联合实验组细胞24、48和72h抑制率分别为17．4％、20．3％、24．3％，37．5％、44．3％、51．2％，52．3％、70．2％、88．2％。各实验组均出现钠泵活性降低，以联合实验组最显著（P〈0．05）。0．1μmol／哇巴因和联合实验组HepG2细胞S期比例从24．2％上升至66．5％和75．2％；实时定量PCR和蛋白质印迹检测显示哇巴因组和联合实验组P21“”＋表达上调而钠泵d1亚单位、MAPKl、CyclinA、CDK2和PCNA表达下调。结论钠泵仅1亚单位siRNA联合哇巴因抑制HepG2细胞钠泵后可抑制细胞增殖，而P21WAF1表达上调和CyclinA／CDK2／PCNA周期调控复合体生成减少可能是引起s期阻滞的主要原因。

哇巴因和华蟾毒配基通过调节ERK信号通路诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的研究

目的:通过检测钠钾泵(Na+/K+-ATPase)抑制剂哇巴因和华蟾毒配基对肿瘤细胞存活的影响,研究其通过调节ERK信号通路诱导肿瘤细胞凋亡的机制。方法:以人肝癌细胞HepG2为靶细胞,检测Na+/K+-ATPase的活性变化,Hochest33342荧光染色检测细胞形态学变化;单细胞电泳检测细胞DNA损伤程度,钙离子荧光探针检测Ca2+浓度变化;Westernblot检测Caspase-3、ERK的表达变化。结果:哇巴因和华蟾毒配基可抑制Na+/K+-ATPase的活性;可使HepG2细胞呈典型的凋亡形态特征;单细胞电泳显示其可损伤HepG2细胞DNA双链;Fluo-3AM检测显示哇巴因和华蟾毒配基促进了Ca2+浓度增高;Western blot显示其可促进Caspase-3的活化,上调ERK磷酸化水平。结论:Na+/K+-ATPase抑制剂可诱导肝癌HepG2细胞凋亡,导致细胞DNA损伤,诱导细胞内游离Ca2+浓度增高,促进细胞凋亡途径中主要蛋白Caspase-3的活化。而ERK信号通路在哇巴因和华蟾毒配基诱导的HepG2细胞凋亡过程中发挥着关键调控作用。