β-淀粉样蛋白致胚胎鼠大脑神经干细胞凋亡作用的研究

目的探讨β-粉样蛋白(amyloid-βprotein,Aβ)对胚胎鼠神经干细胞凋亡作用的影响。淀方法体外培养7d的胚胎鼠神经干细胞,分为正常对照组和实验组,实验组根据Aβ1～40作用终浓度的不同,又分为0.1,1.0,5.0,10.0和20.0μmol/L等5个亚组,分别培养12h、24h、48h及72h。然后经四唑盐实验筛选Aβ1～40致神经干细胞发生凋亡的最佳浓度,再与神经干细胞共同培养。通过Annexin-V磷脂酰丝氨酸荧光标记染色法观察神经干细胞早期凋亡情况;用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)进行染色,观察神经干细胞中晚期凋亡情况。结果(1)经四唑盐筛选实验确定,以终浓度为5.0μmol/L的Aβ1～40作为β-淀粉样蛋白致神经干细胞发生凋亡的最佳诱导剂量。(2)神经干细胞与Aβ1～40(5.0μmol/L)共同培养至6h时,神经干细胞发生早期凋亡,细胞内出现大量绿色荧光标记物,而对照组则未见绿色荧光标记物。(3)神经干细胞与Aβ1～40(5.0μmol/L)共同培养24h时,神经干细胞发生中晚期凋亡,细胞内可见绿色荧光标记物。结论β-粉样蛋白可导致胚胎鼠大脑神经干细胞发生凋亡。

EGF和FGF-2促神经干细胞增殖与分化研究

目的 建立人胚胎大脑神经干细胞的分离培养方法并观察在不同诱导因子作用下细胞分化的生物学特性。方法 将经培养的人胚胎大脑神经干细胞分为4组,在不同培养液中培养、分化:(1)DMEM/F-12标准培养液组;(2)标准培养液+表皮生长因子(EGF)组;(3)标准培养液+碱性成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)组;(4)标准培养液+表皮生长因子+碱性成纤维细胞生长因子-组。用定量RT-PCR方法及免疫组织化学染色方法鉴定神经干细胞的原始特性、端粒酶活性以及不同诱导因子对神经干细胞分化特性的影响。结果 于培养第6d,标准培养液中的脑细胞死亡;而在加入EGF和FGF-2的培养液中则形成神经干细胞球体,而且增殖细胞核抗原染色和神经干细胞巢蛋白表达均呈阳性反应;其端粒酶活性为63％,低于瘤细胞而高于正常脑组织。神经干细胞分化后经胶质纤维酸性蛋白、神经微丝、突触素、微管相关蛋白-2及神经细胞核抗原染色显示,分化的神经元最高值达(18±2.5)％。不同诱导因子对不同传代的细胞球体内神经干细胞的促增殖作用差异有显著性意义(均P<0.05)。结论 EGF和EGF-2均具有促进神经干细胞存活、增殖和分化的作用。

壳聚糖作为中枢神经系统支架材料的可行性研究

目的探索壳聚糖作为中枢神经系统组织工程支架材料的可行性。方法选择孕14～16dWistar大鼠剖宫取胎鼠脑进行分离、培养,经巢蛋白、胶原纤维酸性蛋白、特异性烯醇化酶和半乳糖脑苷酯免疫细胞化学染色鉴定获得神经干细胞,种植于壳聚糖膜和明胶膜表面培养,然后行巢蛋白免疫细胞化学染色,观察神经干细胞在壳聚糖膜和明胶膜表面的贴附、生长和分化状态,以及壳聚糖、明胶的降解速度。结果从胎鼠大脑分离获得的神经干细胞,巢蛋白染色呈阳性反应,可分化形成神经元和胶质细胞,分化细胞分别呈胶原纤维酸性蛋白、特异性烯醇化酶和半乳糖脑苷酯染色阳性反应。神经干细胞接种后12h即贴附于壳聚糖膜表面,24h壳聚糖膜和明胶膜均贴附牢固;48h明胶膜表面神经球周围首先出现带突起的分化细胞,壳聚糖膜迟至生长第3天才出现。神经干细胞接种生长后第3天,壳聚糖膜部分降解,明胶膜完全降解;第4天膜表面长满分化细胞;第5、6天壳聚糖膜大部分降解,分化细胞部分死亡。结论壳聚糖与神经干细胞生物相容,具有促细胞贴附和分化作用,由于机械性能差,不宜作为中枢神经组织工程的结构性生物支架材料,但可以单独或者联合促贴附物明胶作为促神经干细胞贴附和分化的支架表面修饰剂。

缺氧对神经胶质细胞hif-1基因表达和凋亡的影响

目的探讨缺氧环境对培养的新生鼠大脑胶质细胞低氧诱导因子-1(HIF-1)基因表达和凋亡的影响。方法体外培养SD新生鼠大脑神经胶质细胞;实验分为对照组:正常培养6h(5%CO2、95%空气)和缺氧组:缺氧培养6 h(5%CO2、1%O2、94%N2)。实时定量多聚酶链反应(PCR)方法测定细胞hif-1和bcl-2、bax基因表达。结果缺氧组hif-1 mRNA表达高于对照组(P<0.01);缺氧组bcl-2 mRNA表达低于对照组(P<0.05),bax mRNA表达高于对照组(P<0.01)。结果缺氧6 h可引起胶质细胞hif mRNA表达增加但促进细胞凋亡。

低温对大鼠胶质细胞间缝隙连接通讯功能的影响

目的探讨低温治疗对大鼠胶质细胞间缝隙连接通讯功能的影响。方法常规体外培养大鼠神经干细胞,传代2次后加入10％胎牛血清诱导其向神经胶质细胞分化,25个培养皿中胶质细胞培养至致密单层细胞,平均分为5组:常温组,培养皿置入37℃,5％CO2饱和湿度培养箱内继续培养24h; 低温组,置入30℃,5％CO2饱和湿度培养箱内继续培养24h;常温轻度缺氧组,使用封口膜封闭培养皿, 置入37℃,5％CO2饱和湿度培养箱内继续培养24h;低温轻度缺氧组,使用封口膜封闭培养皿,置于30 ℃,5％CO2饱和湿度培养箱内继续培养24h;佛波酯阳性对照组,于37℃,5％CO2饱和湿度培养箱内继续培养22h,加入佛波酯继续培养2h,工作液浓度5ng／ml。各组培养至24h后,利用划痕标记染料示踪技术在激光扫描共聚焦显微镜下,通过荧光黄扩散距离测定胶质细胞间缝隙连接通讯水平。结果常温组染料5min扩散距离为(160．5±8．6)μm;低温组缝隙连接通讯明显受到抑制,扩散距离为(126．2±10．4) μm,与常温组相比差异具有显著性意义(P<0．05);常温轻度缺氧组扩散距离为(154．1±6．9)μm;低温轻度缺氧组扩散距离为(122．8±6．0)μm,与常温轻度缺氧组相比差异亦有显著性意义(P<0．05);但常温组与常温轻度缺氧组相比,低温组与低温轻度缺氧组相比,差异均无显著性意义(P>0．05)。结论低温能够降低神经胶质细胞间缝隙连接通讯功能。

低氧诱导星形胶质细胞血管内皮生长因子表达

目的探讨低氧环境对体外培养的胎鼠大脑星形胶质细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法采用孕16d的SD胎鼠大脑组织培养星形胶质细胞,实验分为正常组(正常培养,5%CO_2,95%空气,37℃,绝对湿度)和低氧组(低氧培养,5%CO_2,2%O_2,93%N_2,37℃、绝对湿度)。MTT实验观察细胞经2、4、6、8、10h低氧培养后细胞增殖情况,免疫荧光染色观察细胞经4、8、12、24、32h低氧培养后VEGF表达的变化。结果低氧组胶质细胞增殖除6h与正常组无差异外,2、4、8、10h较正常组均明显增高,差异有统计学意义(P<0.05);低氧组8、12h VEGF表达明显高于正常组,24、32h VFGF表达明显低于正常组(P<0.05)。结论低氧培养短期可促进星形胶质细胞增殖,VEGF表达升高,长期低氧可至星形胶质细胞损伤,VEGF表达下降。

大鼠成体干细胞食管下段移植的实验研究

目的研究成体干细胞注射至食管下段的可行性,探索利用成体干细胞[骨骼肌卫星细胞(SC)和骨髓间充质干细胞(MSC)]移植治疗胃食管反流病(GERD))的新方法。方法选取体质量 160～240 g的Wistar大鼠,雌雄各半,不同实验组分别于体外培养并扩增骨骼肌SC或MSC, 5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记后,经腹腔将大鼠自体骨骼肌SC悬液植入食管下段肌层;MSC悬液植入同种异体大鼠食管下段肌层。1周和4周后分批处死动物,取食管下段组织并使用组织学方法评价植入细胞生长分化情况。结果 BrdU的细胞标记率接近100％。接受干细胞移植的大鼠生长良好。干细胞移植后第1周和第4周,SC组和MSC组大鼠食管下段均可见大量分化为骨骼肌细胞的 BrdU阳性细胞,SC组第4周较第1周BrdU阳性细胞核数显著增多(P<0．01)。MSC组第4周较第1周 BrdU阳性细胞核计数增多,但差异无统计学意义(P>0．05)。SC组与MSC组比较,第1周BrdU阳性细胞核数差异无统计学意义(P>0．05),第4周SC组较MSC组显著增多(P<0．05)。注射局部未见炎症反应,与对照组病理学分析无差异。结论成体干细胞移植至大鼠食管下段安全、可行,能在食管下段长期存活并分化为骨骼肌。骨骼肌SC或MSC移植可能成为治疗GERD的新方法。