恩拉霉素生物检测方法的改进

试验对国家标准中恩拉霉素的生物检测方法进行了改进,以干燥滤纸片法代替管碟法对不同样品中的恩拉霉素含量进行了测定;并研究了浸提液组成、浸提时间、检定菌浓度等因素对检测结果的影响,建立了恩拉霉素浓度与抑菌圈直径之间的线性方程。研究结果表明,利用丙酮浸提液A(丙酮:1mol/mL HCl∶水=35∶12∶56,用1mol/mL HCl将pH调至3.0)浸提供试品,浸提时间3.5h,可以充分浸提供试品中的恩拉霉素;使用生物测定指示菌CMCC(B)63501芽孢数为3.4×107个/mL的平皿,形成的抑菌圈边缘规则清晰,准确度好;使用干燥滤纸片法可有效消除浸提液或酸性稀释液本身对检测菌株的抑制作用,且操作简单、重复性好,可以同时对大批量的样品进行恩拉霉素含量的测定。恩拉霉素标准溶液在浓度为150~500U/mL的范围内,其产生的抑菌圈直径与效价有较好的线性回归性,所得回归方程:Y=0.00944X+11.55344,相关系数R=0.9962,最终有效区间是0.75~2.5U,测得的结果更接近真实值,可作为一种高效、快速的恩拉霉素含量测定方法,值得推广和使用。

非核糖体肽的生物合成研究进展

非核糖体肽(nonribosomal peptide,NRP)是由多种微生物通过非核糖体肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase,NRPS)等催化合成的一类小分子多肽类次级代谢产物,具有抗菌、抗肿瘤、免疫抑制等多种生物活性,是一类重要的微生物药物,具有很高的临床应用价值。从目前已发现的小分子多肽类天然药物出发,综述了该类物质的生物功能、合成组装机制以及近年来在工程改造方面的进展,并提出了未来研究发展方向,对进一步通过组合生物合成等方式高效合成更多种类的小分子多肽类活性物质具有借鉴意义。

通过失活Sec途径阻遏蛋白和胞外蛋白酶提高地衣芽孢杆菌产碱性蛋白酶的能力

为了探究Sec分泌途径对地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)碱性蛋白酶产量的影响,对地衣芽孢杆菌TCCC11470(BLΔuppΔepsΔpgs)中的分子伴侣阻遏蛋白基因hrcA和基因组中3个Sec途径分泌的胞外蛋白酶基因epr、bpr和vpr进行叠加敲除。通过对比分析基因缺失前后的碱性蛋白酶酶活力发现,敲除菌株TCCC11470ΔhrcA和TCCC11470ΔhrcAΔeprΔbprΔvpr在42 h的碱性蛋白酶酶活力分别达到18521.2 U/mL和20048.5 U/mL,分别高出对照菌株BLΔuppΔepsΔpgs(14478.6 U/mL)27.9%和38.5%。这一结果指出,通过改进Sec分泌通路可以显著提升碱性蛋白酶的催化效能,为构建优化的工业酶生产宿主提供了新思路和研究方向。

恩拉霉素生产菌株的遗传改造

【目的】提高杀真菌素链霉菌发酵生产恩拉霉素的产量。【方法】利用定点突变技术,对恩拉霉素生产菌株杀真菌素链霉菌F1中影响细胞次级代谢及抗生素合成的核糖体S12蛋白的编码基因rps L进行改造,将第43位的赖氨酸(Lys)分别替换为天冬酰胺(Asn)和精氨酸(Arg),并对改造菌株L-M1(Asn43)和L-M2(Arg43)的生长特性、抗生素合成以及摇瓶发酵性能进行研究。【结果】与野生型菌株相比,改造菌株的生长特性及生理生化特性均发生了明显的改变:产孢周期明显缩短,野生型菌株在MS培养基中,28°C下需要培养5-7 d后才能产生孢子,而在相同条件下,改造菌株3 d后就能产生大量的孢子;恩拉霉素产量相对提高,摇瓶发酵条件下,改造菌株L-M1(Asn43)和L-M2(Arg43)的恩拉霉素产量分别可达到1 334 U/m L和1 456 U/m L,与野生型菌株F1相比分别提高了11.9%和22.1%。【结论】通过遗传改造,恩拉霉素的产量得到了提高,为其他位点的遗传改造提供了可行性。