基因工程抗体抗CD19(Fab)-LDM的制备及生物学活性研究

目的构建及表达抗CD19(Fab)-LDP(LDP为LDM辅基蛋白)融合蛋白,制备强化融合蛋白anti-CD19(Fab)-LDM,进行体外生物活性的研究。方法采用基因克隆技术,构建基因重组质粒pAZYanti-CD19(Fab)-LDP,测序进行鉴定,转化至大肠杆菌进行表达,表达产物经Protein G亲和层析柱纯化后,进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定;采用流式细胞检测技术(FACS)和激光共聚焦显微镜技术,检测融合蛋白与B淋巴瘤Raji细胞的结合活性;采用间接免疫荧光法,检测CD19介导细胞内化的情况;采用MTT法检测强化融合蛋白anti-CD19(Fab)-LDM对CD19+Raji细胞的靶向杀伤活性;采用彗星电泳的方法,检测强化融合蛋白对Raji细胞DNA的损伤程度。结果用基因工程方法成功的构建、表达融合蛋白anti-CD19(Fab)-LDP,Protein G亲和层析柱纯化后在SDS-PAGE上表现为相对分子质量约60 ku蛋白条带,且融合蛋白可与Raji细胞特异结合,并能介导细胞的内化;强化融合蛋白对Raji细胞具有较强的细胞毒性,并能引起细胞DNA损伤。结论强化融合蛋白anti-CD19(Fab)-LDM可以靶向作用于B淋巴瘤细胞,并具有较强的抗肿瘤活性,在恶性B淋巴瘤生物治疗中具有潜在的应用价值。

重组大肠杆菌高密度发酵工艺进展及研究

随着现代科技技术的不断发展,我国各行各业的相关技术都有着明显的提高。发酵技术是现代生物科技、医疗科技以及食品制造等行业的基础技术,可以有效提升基因工程技术产品的产量和质量。本文即是对重组大肠杆菌高密度发酵技术的进展进行研究,其主要通过宿主菌类型、培养基类型、碳源含量、无机盐含量、诱导剂类型、抑制性代谢物的影响这6大方面进行探讨,了解不同条件下对大肠杆菌本身和重组蛋白的影响,以期能为相关工作提供参考。

强化融合蛋白抗CD20（Fab）-力达霉素对淋巴瘤BJAB细胞增殖和DNA损伤的作用

目的研究强化融合蛋白抗CD20（Fab）．力达霉素（LDM）体外对CD20表达阳性的淋巴瘤细胞株BJAB增殖和DNA损伤的作用。方法流式细胞术检测融合蛋白抗CD20（Fab）-力达霉素辅基蛋白（LDP）与BJAB细胞的结合活性；激光共聚焦显微镜观察融合蛋白抗CD20（Fab）-LDP靶向结合BJAB细胞情况；M_rr法检测强化融合蛋白抗CD20（Fab）-LDM对BJAB细胞的生长抑制作用；单细胞凝胶电泳（SCGE）检测强化融合蛋白抗CD20（Fab）-LDM对DNA的损伤；流式技术检测强化融合蛋白抗CD20（Fab）-LDM诱导BJAB细胞的细胞周期的改变。结果融合蛋白抗CD20（Fab）-LDP与BJAB细胞结合活性为阳性；激光共聚焦显微镜下观察，融合蛋白抗CD20（Fab）．LDP靶向结合在BJAB细胞表面；强化融合蛋白抗CD20（Fab）．LDM作用于淋巴瘤BJAB细胞后，可以显著抑制BJAB细胞的生长，引起DNA损伤，诱导S期阻滞。结论强化融合蛋白抗CD20（Fab）-LDM可以靶向结合淋巴瘤BJAB细胞，并且具有显著的生长抑制作用，其作用机制是引起DNA的损伤。

人类B细胞淋巴瘤耐药细胞株BJAB/ADR的建立及其耐药机制的初步研究

目的 建立人类淋巴瘤B JAB多药耐药细胞株BJAB/ADR,并初步研究其耐药机制.方法 采用多柔比星浓度梯度递增法建立人类B细胞淋巴瘤耐药细胞模型BJAB/ADR,观察其生长规律并绘制细胞生长曲线;用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法鉴定耐药细胞株对多种化疗药物的耐药性并计算耐药指数;提取耐药细胞株RNA,实时定量聚合酶链反应（PCR）法检测相关耐药基因MDR1 mRNA的表达;流式细胞术检测细胞表面P糖蛋白（Pgp）的表达;通过罗丹明外排实验,检测Pgp功能.结果 成功建立B细胞淋巴瘤耐药细胞模型BJAB/ADR,并在160 ng/ml多柔比星溶液中稳定生长,耐药细胞较敏感细胞生长缓慢,细胞形态无明显变化.MTT检测结果表明BJAB/ADR细胞对多柔比星的耐药指数为43倍,同时对柔红霉素、依托泊苷、高三尖杉酯碱（HHT）及米托蒽醌（MX）也具有一定的耐药性.实时定量PCR结果表明,耐药细胞BJAB/ADR MDRl mRNA明显高于药物敏感细胞BJAB（P＜ 0.01）.流式细胞术检测结果显示,耐药细胞表面Pgp高表达;罗丹明外排实验表明Pgp对多柔比星具有外排功能,使B JAB/ADR细胞获得耐药特性.结论 建立了人类B细胞淋巴瘤的耐药细胞株BJAB/ADR,其对多柔比星耐药性稳定,并呈现多药耐药细胞的基本生物学特性,为进一步研究肿瘤多药耐药发生的机制及逆转耐药提供有利的模型.