体外表达GLP-1多拷贝的最优条件研究

目的:探讨胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的序列拷贝数及拷贝温度、时间与其体外表达水平的关系。方法:首先将以4拷贝数为单位的GLP-1序列插入到p ET-22b(+)中构建GLP-1多拷贝表达载体,然后将表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行蛋白体外培养表达。取不同温度和诱导时间段进行蛋白表达,检测GLP-1在不同条件下的蛋白表达量,优化蛋白最适表达条件。结果:GLP-1多拷贝在BL21菌株中的最佳表达温度为26℃,最适诱导时间为8 h。拷贝数与GLP多拷贝表达量呈负相关性,拷贝数越多,蛋白产量越低。结论:GLP多拷贝最佳体外表达条件为4拷贝,26℃培养IPTG诱导8 h。

人脐带间充质干细胞对咪喹莫特诱导的银屑病样皮炎小鼠模型的治疗作用

目的研究人脐带间充质干细胞(MSC)对咪喹莫特诱导的银屑病样皮炎小鼠模型的治疗作用及机制。方法将18只C57BL/6小鼠按随机数字表等分为凡士林组、模型组和治疗组,每组6只。小鼠背部剃毛后,模型组和治疗组小鼠背部涂抹5%咪喹莫特乳膏62.5 mg每天1次,连续6 d,凡士林组小鼠涂抹等量的凡士林软膏;治疗组小鼠在第1、4天予尾静脉注射1.5×10^(6)个MSC。根据银屑病面积和严重程度指数(PASI),每日评估小鼠背部皮损严重程度。末次涂药24 h后(第7天)取血并处死小鼠,取背部皮肤行HE染色,切取脾脏并获取单细胞悬液,流式细胞仪检测脾脏中Th1、Th17细胞亚群。酶联免疫吸附试验检测血清中细胞因子白细胞介素(IL)-17A及肿瘤坏死因子(TNF)-α水平。多组间比较采用单因素方差分析,两两多重比较采用Tukey检验,PASI评分随时间变化的数据采用重复测量的方差分析。结果第7天,模型组小鼠背部出现明显的鳞屑性红斑,皮肤厚度为(78.73±23.11)μm,凡士林组为(13.28±4.57)μm,两组比较,q=19.25,P<0.001,模型组炎性细胞浸润数亦显著增加(q=7.21,P<0.001)。治疗组小鼠PASI评分、表皮厚度、炎性细胞浸润数均显著低于模型组(均P<0.001)。治疗组小鼠脾脏Th17细胞亚群比例、血清TNF-α水平显著低于模型组(P<0.05)。治疗组与模型组之间脾脏重量、脾指数、脾脏细胞计数、Th1细胞亚群比例及血清IL-17A水平差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论人脐带MSC可减轻咪喹莫特诱导的银屑病样皮炎小鼠模型皮肤炎症,机制可能与抑制Th17细胞及TNF-α的生成有关。

脐带间充质干细胞通过调节IL-6延缓小鼠银屑病样皮损的研究

目的通过咪喹莫特(IMQ)乳膏涂抹诱导产生银屑病样皮损的小鼠模型,观察人源脐带间充质干细胞(hUCMSCs)对其整体和局部作用效果。方法C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组和hUC-MSCs组,模型组和hUC-MSCs组每日定时在小鼠裸露背部涂抹5%IMQ乳膏62.5 mg,对照组涂抹凡士林。在开始涂抹前1天(0 d)和涂抹后的第6天,对照组和模型组sc 200μL的生理盐水,hUC-MSCs组每只小鼠sc 2×10^(6)个hUC-MSCs。采用银屑病样皮损面积和疾病严重指数(PASI)评分标准观察银屑病样小鼠模型皮损变化情况;通过HE染色观察表皮层厚度,角质层角化程度及炎性细胞浸润程度;采集小鼠的静脉血,试剂盒法检测血清白细胞介素-6(IL-6)的浓度,评估小鼠炎症反应。结果hUC-MSCs组与同期模型组比较,皮损症状轻,通过PASI积分趋势图可见,hUC-MSCs能延缓皮损出现,同时减缓皮损严重程度,加快皮损部分的恢复;HE染色显示,hUC-MSCs组角化不全的细胞明显减少,红细胞外溢真皮层增生和炎性细胞浸润程度明显低于模型组,造模后6 d表皮层厚度显著低于模型组(P<0.01);hUC-MSCs组血清IL-6浓度在造模后的第12天显著低于模型组。结论银屑病样小鼠模型sc hUC-MSCs后能延缓银屑病的发生,并减轻银屑病症状,加快银屑病样皮损部分的恢复,可能通过调节IL-6发挥免疫调节作用。

脐带来源间充质干细胞的免疫抑制功能研究

目的观察人源脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)对异体总淋巴细胞和不同淋巴细胞亚群增殖能力的影响,以及对细胞因子分泌的影响。方法分离并培养hUC-MSCs及健康成人外周血淋巴细胞,以淋巴细胞为阴性对照,MTT法检测共培养(淋巴细胞∶hUC-MSCs为1∶0.5、1∶1、1∶5、1∶10)3 d后淋巴细胞的增殖情况;流式细胞仪检测共培养体系中CD4^(+)CD25^(+)FOXP3^(+)、CD3-CD16^(+)CD56^(+)、CD4^(+)CD45RA^(+)CCR7^(+)的细胞比例;ELISA法检测白细胞介素(IL)-2、IL-4、IL-10、γ-干扰素(INF-γ)细胞因子分泌情况。结果与阴性对照组比较,hUC-MSCs对淋巴细胞的增殖具有显著抑制作用(P<0.05),抑制效果随数量增加而增强;hUC-MSCs能够显著增加共培养体系中CD4^(+)CD25^(+)FOXP3^(+)细胞比例(P<0.05),显著降低CD4^(+)CD45RA^(+)CCR7^(+)细胞比例(P<0.05),对CD3^(-)CD16^(+)CD56^(+)细胞比例无显著影响;hUC-MSCs能够显著降低IL-2、IL-4、INF-γ水平,显著增加IL-10的分泌水平(P<0.05)。结论hUC-MSCs具有免疫抑制功能。

人源脐带间充质干细胞对膝骨关节炎模型大鼠的治疗作用

目的观察人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)对SD大鼠膝骨关节炎的治疗效果。方法8周龄近交系SD雄性大鼠6只,均采用自身双侧对照研究。应用手术方法切断双膝关节前交叉韧带,手术后不固定伤肢,笼内自由活动。术后4周,右侧作为模型侧,左侧膝关节注射hUC-MSCs 100μL(1×10^(7)cells/mL)。注射后4周,处死所有实验组大鼠并收取双侧膝关节标本,进行HE和甲苯胺蓝染色。结果模型侧细胞排列紊乱,细胞簇集明显,有细胞消失、基质染色不均、软骨结构改变、表面凹凸不平、软骨层次较差等现象,表明软骨蜕变,骨关节炎形成;hUC-MSCs治疗侧与模型侧相比,软骨细胞排列基本整齐,呈柱状,细胞增生较多,细胞簇集明显减少,潮线较完整。软骨表面相对平滑,表明软骨处于损伤修复中。结论hUC-MSCs移植治疗有助于改善大鼠膝骨关节炎,使大鼠关节软骨破坏减轻,促进软骨组织修复。

人脐带间充质干细胞复方电解质注射液制剂的制备及稳定性研究

目的探索人脐带间充质干细胞复方电解质注射液制剂稳定性。方法人脐带间充质干细胞(密度5×10^(5)/mL)分别与复方电解质注射液及0.9%氯化钠注射液(分别设加/不加2%人血白蛋白组)制备制剂,通过观察24 h内不同时间节点凋亡变化趋势优选出制剂方案;探讨该制剂的光照稳定性、热循环稳定性、加速稳定性以及长期稳定性。结果复方电解质注射液制剂较0.9%氯化钠注射液制剂细胞凋亡水平低;2%白蛋白添加能够有效降低细胞凋亡水平。光照对复方电解质注射液添加2%白蛋白细胞制剂无严重影响;温度波动能导致细胞存活率快速下降;高温对细胞制剂状态有较大影响,导致絮状物大量出现,细胞存活率快速下降;在低温条件下,该制剂能长时间保持细胞存活率。结论复方电解质注射液添加2%白蛋白是一种优良的人脐带间充质干细胞制剂方法。