激动样活性抗α_1-肾上腺素受体胞外第二肽段抗体的制备

目的:制备提纯抗α1-肾上腺素受体抗体,并对其生物学活性进行鉴定。方法:实验于2003-02/12在华中科技大学同济医学院附属协和医院完成。①选取清洁级1月龄雄性Wistar大鼠6只,取4只用于抗α1-肾上腺素受体抗体的制备。将合成肽用戊二醛与牛血清白蛋白偶联,透析除去未结合的多肽,与等体积的弗氏佐剂混匀后于0,2,4,6,8周对大鼠进行免疫处理,4只/次。另2只作为未免疫对照。免疫前后鼠尾采血并用ELISA法检测抗体的滴度,α1-肾上腺素受体抗原的包被浓度50mg/L,血清稀释度从1∶40开始倍比稀释,辣根过氧化物酶酶标抗体稀释度为1∶2000。用阳性血清与阴性血清的吸光度之比来判定,比值≥2.1为阳性。免疫结束后采血,离心取上清,与等体积的生理盐水混合后逐滴加入饱和硫酸铵至浓度达50%,于磷酸盐缓冲液中透析。②以合成的α1-肾上腺素受体胞外第二肽段多肽为抗原,采用免疫亲和层析的方法,纯化用合成肽免疫大鼠产生的抗α1-肾上腺素受体多克隆抗体,用Bradford对抗体进行定量,十二烷基硫酸钠-聚丙烯凝胶电泳检测抗体纯度,以ELISA法、免疫组化、免疫印迹方法进行抗体免疫活性分析,用激光共聚焦测量细胞内游离钙浓度变化以检测抗体的激动样活性。结果:实验选取清洁级1月龄雄性Wistar大鼠6只,全部进入结果分析。①抗α1-肾上腺素受体抗体的产生和纯度:抗α1-肾上腺素受体抗体在大鼠免疫后2周开始产生,8周后达到很高滴度。提纯的抗体聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定有较高的纯度。②纯化的抗α1-肾上腺素受体抗体的免疫学活性:抗体浓度为0.1g/L时滴度约1∶2560,并可结合培养平滑肌细胞及心肌组织上的α1-肾上腺素受体,具有较好的反应原性。③纯化的抗α1-肾上腺素受体抗体的生物学活性:抗α1-肾上腺素受体抗体可显著升高分离的成年大鼠心肌细胞游离钙离子浓度,高达(139.6±15.5)%。该抗体的作用可被Prazosin阻断,降至(28.9±12.64)%,具有特异性及激动样活性。结论:采用自制的免疫亲和层析柱可将合成肽免疫产生的具有激动样活性的抗α1-肾上腺素受体抗体纯化。