正常和病变的口腔黏膜上皮细胞对α干扰素的敏感性差异研究

目的观察正常和不同病变程度的口腔黏膜上皮细胞对α干扰素(IFN-α)敏感性的差异,为IFN-α的抗肿瘤应用和机制的研究提供基础。方法分别培养正常口腔黏膜上皮细胞株(NOK)、口腔黏膜异常增生上皮细胞株(DOK)、口腔表皮样癌细胞株(KB),取传至第3代对数生长期细胞接种于细胞培养板,对照组每孔加入2 m L含10%胎牛血清的完全培养液,实验组设IFN-α浓度100、500、1 000 U/m L 3个浓度组,实验组每孔分别加入含相应浓度IFN-α的完全培养液,常规培养24 h后检测细胞增殖能力、细胞凋亡和细胞周期变化情况。结果不同浓度的IFN-α分别作用于3种细胞,对NOK细胞株的增殖能力无影响,而DOK、KB细胞株各实验组与对照组相比增殖能力明显减慢,差异均有显著统计学意义(均P<0.01)。浓度500 U/m L IFN-α对NOK细胞株的凋亡无影响,但有促进DOK、KB细胞株凋亡的作用。浓度500 U/m L IFN-α对NOK细胞株周期无影响,DOK细胞株G0/G1期细胞比例显著减少,而G2/M期细胞比例显著增加,KB细胞株G2/M期细胞比例显著增加。结论正常上皮细胞对IFN-α不敏感,而DOK、KB细胞株对IFN-α敏感;IFN-α有抑制DOK、KB细胞株的增殖能力、促其凋亡的作用,且细胞周期阻滞于G2/M期。

ATM/ATR-p53-Bcl2/Bax通路在PRPS2表达下调致HCT116凋亡中的作用研究

共济失调毛细血管扩张征突变基因（ataxia-telangiectasia mutated gene,ATM）属于一种DNA修复基因,定位于染色体11q22-q23。本研究拟采用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法和Western blot检测ATM/ATM与Rod 3相关蛋白激酶（ATR）-p53-Bcl2/Bax通路中关键基因ATM、ATR、p53、Bax、Bcl-2表达变化。以期阐明PRPS2表达下调致HCT116凋亡发生的分子机制。

人乳头瘤病毒与宫颈癌患者循环血中微小RNA218相关性研究

目的探讨人乳头瘤病毒(HPV)与宫颈癌患者循环血中微小RNA(miRNA)218的关系。方法收集宫颈癌患者作为病例组,选取年龄与病例组匹配并符合对照组标准的子宫肌瘤作为对照组。采血并测定对照组和病例组循环血中的miRNA218水平,分析病例组中不同HPV亚型感染患者的血miRNA218表达水平;以及不同病理分期宫颈癌患者的血miRNA218表达水平。结果病例组患者中HPV16亚型和HPV18亚型感染的患者血中miRNA218表达水平明显低于对照组和病例组HPV其他亚型感染者(P<0.01);宫颈癌Ⅰ期患者血中miRNA218表达水平明显低于对照组(P<0.01);并且宫颈癌Ⅱ期患者血中miRNA218表达水平明显低于宫颈癌Ⅰ期(P<0.05)和对照组(P<0.01)。结论循环血中miRNA218水平和宫颈癌侵袭程度密切相关;并且高危HPV亚型HPV16和HPV18感染患者与循环血中miRNA218水平密切相关。

Octamer 4基因在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

目的检测Octamer 4(Oct-4)基因在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达,探讨Oct-4在NSCLC发生、发展中的作用。方法采用流式细胞仪分选出肺癌细胞系A549中Oct-4+及Oct-4-的细胞群,用免疫荧光法检测分选后的细胞亚群中CD133的表达情况;采用体外侵袭实验检测Oct-4+细胞群和Oct-4-细胞群的侵袭能力。结果 1以标记Oct-4通过流式细胞仪分离后,成功获得肺癌细胞株A549中Oct-4+细胞群和Oct-4-细胞群。且Oct-4+细胞群中CD133的表达明显高于Oct-4-细胞群,差异有统计学意义(P<0.05)。2Oct-4+细胞群的侵袭细胞数显著高于Oct-4-细胞群,差异有统计学意义(P<0.05)。3Oct-4在NSCLC中的表达率为83%(50/60),且Oct-4+细胞群中CD133的表达明显高于Oct-4-细胞群,两者比较差异有统计学意义(P<0.05);且Oct-4的表达与NSCLC组织的分化程度、肿瘤的临床分期及是否已经发生淋巴结转移有关,差异有统计学意义(P<0.05)。结论干细胞标志物Oct-4在NSCLC干细胞亚群中呈高表达,可能与肺癌的发生、发展及转移密切相关,为肺癌治疗提供新的靶点。

PRPS2基因shRNA质粒的构建与表达

目的构建磷酸核糖焦磷酸合成酶2(phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 2,PRPS2)基因shRNA质粒,为探讨PRPS2基因功能奠定基础。方法设计并合成PRPS2基因shRNA,将其分别与真核表达载体GV102重组为shRNA质粒,分别命名为GV102-PRPS2-1、GV102-PRPS2-2、GV102-PRPS2-3,分别转染这三种载体的细胞设为实验组1、2、3;阴性对照载体命名为GV102-PRPS2-0,转染该载体设为阴性对照组;分别测序鉴定。常规转染人结肠癌HCT116细胞后采用RT-PCR、Western blot检测细胞PRPS2基因的表达水平,筛选干扰效果最佳shRNA载体。结果设计并合成的PRPS2干扰载体,经测序鉴定序列正确。转染HCT116细胞后在72 h内发绿色荧光的细胞数量随时间的增加而增强,转染效率均介于40%-50%。RT-PCR和Western blot结果显示,转染shRNA质粒的3个实验组PRPS2表达均较阴性对照组显著下降(P<0.05),其中GV102-PRPS2-3使细胞中PRPS2的mRNA(0.27±0.05)水平下降73%、蛋白(0.30±0.04)水平下降70%,干扰效果优于GV102-PRPS2-1(mRNA:0.61±0.03,蛋白:0.37±0.06)和GV102-PRPS2-2(mRNA:0.89±0.02,蛋白:0.84±0.05)。结论本研究利用RNAi技术下调了人结肠癌HCT116细胞中PRPS2基因的表达,为深入探讨PRPS2表达下调后对细胞行为的影响奠定了研究基础。

肿瘤免疫中CD4+CD25+CD127low/-调节性T细胞作用研究

目的研究调节性T细胞在癌症患者血液中的数量,探讨其在肿瘤免疫中的意义.方法应用流式细胞术检测78例癌症患者及68例健康人群外周血中CD4^+CD25^+CD127^low/-Treg占CD4+T细胞的比例;采用PCR方法检测其中Foxp3基因表达情况.结果癌症患者与正常对照组相比,外周血中CD4^+CD25^+CD127^low/-Treg细胞比例为(5.89±1.74)%显著高于正常对照组(2.17±0.93)%(t=-16.40,P<0.05),且不同分期实验组Treg细胞比例均显著高于正常对照组(P<0.05);外周血中Foxp3相对表达量为(2.65±0.92)%显著高于正常对照组(1.57±0.47)%(t=-9.06,P<0.05),且不同分期实验组Foxp3相对表达量均显著高于正常对照组(P<0.05).结论CD4^+CD25^+CD127^low/-Treg细胞可能在导致机体免疫抑制,发生肿瘤免疫逃逸中发挥着一定作用.

细胞因子信号抑制因子1基因真核高表达质粒的构建及其在NOK细胞中的表达

目的构建细胞因子信号抑制因子1(suppressors of cytokine signaling 1,SOCS1)基因真核高表达质粒,并在口腔上皮细胞系NOK细胞中进行表达。方法提取健康人外周静脉血基因组DNA,PCR扩增SOCS1基因,与p EGFPN1载体连接,构建重组真核表达质粒p EGFP-N1-SOCS1,用Eco RⅠ和Bam HⅠ双酶切鉴定及测序后,转染NOK细胞,采用荧光显微镜及Western blot法检测转染细胞中SOCS1蛋白的表达。结果重组真核表达质粒p EGFP-N1-SOCS1经双酶切及测序鉴定证实构建正确。p EGFP-N1-SOCS1转染NOK细胞72 h后获得表达,SOCS1蛋白的表达量为(134.67±9.07)%,较转染空质粒组约升高4倍,二者差异有统计学意义(P=0.001)。结论成功构建了SOCS1基因真核高表达质粒,为进一步研究SOCS1的生物学功能奠定了基础。