帕金森病体外实验细胞模型的建立

目的:探讨1-甲基-4-苯基-四氢吡啶离子(MPP+)对小鼠胚胎中脑原代培养多巴胺能神经元的毒性作用及其机制。在体外建立帕金森病(PD)实验研究的细胞模型。方法:采用小鼠胚胎(孕14d)中脑进行原代细胞培养,实验分为对照组和不同浓度(0.1、1、10和15μmol.L-1)MPP+药物实验组,应用酪氨酸羟化酶(TH)免疫化学细胞染色方法和Hoechst33342荧光染色对多巴胺能神经元的损伤及凋亡进行测定。结果:对照组中多巴胺能神经元的数量为(875±23)个/孔。在0.1、1、10和15μmol.L-1MPP+实验组,多巴胺能神经元的数量分别为(612±25)、(586±32)、(459±16)和(435±19)个/孔,与对照组比较,MPP+实验组多巴胺能神经元数量均明显降低(P<0.05),多巴胺能神经元突起的数目和长度明显减少。Hoechst33342染色发现,对照组中凋亡细胞数占总细胞数的(5.45±0.29)%,10μmol.L-1MPP+药物治疗组细胞凋亡率为(26.97±1.36)%,显著高于对照组水平(P<0.05)。结论:0.1、1、10和15μmol.L-1MPP+均引起多巴胺能神经元的数量显著减少,随着药物浓度的增加,多巴胺能神经元减少的程度越显著。MPP+引起的多巴胺能神经元的变性死亡可能通过凋亡途径所诱导。

谷氨酸对小鼠胚胎中脑原代细胞培养中多巴胺能神经元损伤的时程效应

目的:探讨谷氨酸兴奋性损伤诱导小鼠胚胎中脑原代培养多巴胺能神经元损伤的时程效应,阐明谷氨酸兴奋性毒性在帕金森病(PD)模型中对多巴胺能神经元损伤的作用。方法:取孕14d小鼠胚胎的中脑组织制备成细胞悬液,进行原代培养,分为对照组和谷氨酸用药组。细胞在体外培养第10天,加入500μmol·L-1谷氨酸并作用15min,分别于用药后2、4、6、24和48h进行酪氨酸羟化酶(TH)免疫细胞化学染色。在显微镜下计数TH染色阳性神经元数量及每个神经元突起数量。结果:对照组中每个培养孔多巴胺能神经元的数量平均为(778.0±18.6)个,谷氨酸用药组2、4、6、24和48h多巴胺能神经元数量平均为(306.0±8.6)、(314.0±15.4)、(298.0±19.1)、(307.0±18.5)及(323.0±23.8)个。谷氨酸用药各组中多巴胺能神经元数量较对照组明显减少(P<0.05),但谷氨酸用药组2、4、6、24和48h多巴胺能神经元数量比较差异无显著性(P>0.05)。随机选取每组100个多巴胺能神经元的突起进行计数,对照组多巴胺能神经元的突起数量平均为(3.440±0.106)个,谷氨酸用药组2、4、6、24和48h时多巴胺能神经元突起数量分别为(2.240±0.105)、(2.390±0.103)、(3.070±0.105)、(3.420±0.987)和(3.420±0.923)个。谷氨酸用药后2和4h多巴胺能神经元的突起数量较其他各组均明显减少(P<0.05)。结论:谷氨酸可在体外诱导小鼠胚胎中脑原代培养中多巴胺能神经元的损伤和死亡,是一个相对急性、不可逆的损伤过程,但随着损伤后恢复时间的延长,损伤的多巴胺能神经元形态可恢复。

胞二磷胆碱对1-甲基-4-苯基吡啶诱导的多巴胺能神经元损伤的保护作用

目的:探讨胞二磷胆碱对1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)诱导的多巴胺能神经元数量减少及形态学改变的影响。方法:体外原代培养怀孕第14天小鼠胚胎中脑神经元,采用MPP+(10μmol·L-1)在体外建立多巴胺能神经元损伤细胞模型。实验分为对照组、单纯MPP+药物组及5个不同浓度胞二磷胆碱(0.01、0.10、1.00、10.00和100.00μmol·L-1)与MPP+共同给药组。应用酪氨酸脱氢酶免疫化学染色方法观察不同浓度胞二磷胆碱对MPP+诱导多巴胺能神经元损伤的形态及数量的变化。结果:体外培养第12天,单纯MPP+药物组中多巴胺能神经元的数量明显少于对照组(P<0.05);0.10μmol·L-1和100.00μmol·L-1胞二磷胆碱治疗组,多巴胺能神经元的数量分别高于单纯MPP+药物组(11.83%和21.26%)(P<0.05)。0.10和100.00μmol·L-1胞二磷胆碱加MPP+药物组中多巴胺能神经元的突起长度明显高于单纯MPP+药物组(P<0.05)。结论:胞二磷胆碱可有效地防止MPP+的多巴胺能神经元的损伤和死亡,可能为帕金森氏病的防治提供一个新途径。

MPP^+诱导小鼠胚胎中脑组织原代培养多巴胺能神经元的损伤与死亡

目的:探讨1-甲基-4-苯基-四氢吡啶离子(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPP+)诱导小鼠胚胎中脑原代培养多巴胺能神经元损伤。方法:采用OF1/SPF小鼠胚胎(孕14d)中脑进行原代细胞培养,将培养细胞分为对照组和MPP+给药组。于体外培养第10天,在MPP+给药组分别加入含有0·1、1·0、10·0和15·0μmol·L-14个不同浓度的MPP+的培养液,持续作用48h后,经酪氨酸羟化酶(TH)免疫组化染色,显微镜下观察、计数多巴胺能神经元。于体外培养10d,在MPP+给药组的培养液中加入终浓度为10μmol·L-1MPP+,分别于给药后2、4、8、24、48、72和96h进行TH免疫组化染色,显微镜下计数TH染色阳性神经元,明确MPP+引起多巴胺能神经元损伤和死亡的时程变化。结果:0·1、1·0、10·0和15·0μmol·L-1浓度的MPP+给药组中平均每培养孔中的TH染色阳性神经元的数量分别为对照组的(70·30±6·38)%、(67·39±4·92)%、(51·68±2·95)%和(50·91±5·60)%。MPP+给药组中,多巴胺能神经元的损伤表现为两种不同形态:绝大多数多巴胺能神经元表现为神经突起的数目及长度明显减少,极少数为胞体空虚、丢失,仅存神经突起。10μmol·L-1MPP+分别作用24、48、72和96h的MPP+给药组中,TH染色阳性神经元的数量每培养孔分别为(677·2±6·1)、(411·5±26·6)、(229·0±20·3)和(191·3±15·2)个,与对照组[(839·8±15·5)个/培养孔]相比明显减少(P<0·05)。结论:0·1、1·0、10·0和15·0μmol·L-1浓度的MPP+均可诱导的多巴胺能神经元的损伤和死亡,其损伤程度与MPP+药物浓度和持续作用的时间呈依赖关系;MPP+诱导多巴胺能神经元的损伤和死亡可能存在2种不同的机制。