反转录病毒载体介导RNA干扰抑制EphA2在Hela细胞中的蛋白表达

目的:课题前期发现EphA2和配体EphrinAl在宫颈鳞癌细胞和肿瘤相关血管内皮细胞均呈高表达,为基因治疗宫颈癌提供了理想的靶向。以此为基础,利用反转录病毒载体介导的RNA干扰抑制EphA2在Hela宫颈癌细胞中的蛋白表达。方法:实验于2006-01/06在河南省肿瘤病理重点实验室完成。①实验材料:PA317细胞、Hela229细胞购自上海生化细胞所,小鼠NIH3T3细胞为本室保存。EphA2兔抗人多克隆抗体,Actin兔抗人多克隆抗体(美国SantaCruz公司)。②实验方法:从EphA2的mRNA全序列中筛选出1个19nt的靶序列,设计双链发夹结构。以siRNA互补双链寡核苷酸,构建反转录病毒表达载体pSIREN-EphA2,提取质粒,用BglⅡ和EcoRⅠ双酶切进行鉴定。选择经酶切鉴定的正确克隆测序。挑选pSIREN-EphA2抗性克隆细胞扩增,检测转染后Hela细胞中EphA2蛋白的表达水平。结果:①pSIREN-EphA2重组质粒的酶切鉴定:双酶切后形成328bp和6182bp两条电泳条带。②pSIREN-EphA2重组质粒测序:结果与已知序列完全一致。③EphA2蛋白的表达:经Westernblot分析,重组pSIREN-EphA2转染的Hela细胞中EphA2蛋白表达水平明显降低。结论:通过反转录病毒载体介导的RNA干扰,能够抑制EphA2在Hela细胞中的蛋白表达,为以EphA2为靶点的宫颈癌基因治疗提供新的思路和手段。