黑色素前体多巴和多巴胺培养后的中华按蚊蛹体壁结构特征及其转录组分析

【目的】筛选出促黑化条件下中华按蚊Anopheles sinensis蛹体壁中表达变化最显著的基因类群,并初步探究它们与黑色素前体累积及表皮结构特征间的相关性。【方法】在Grace’s昆虫细胞培养基中添加黑色素前体多巴(dopa)和多巴胺(dopamine),对化蛹20 min内中华按蚊体壁进行体外培养,对照组(CK)中不添加黑色素前体,培养16 h时利用体视显微镜观察黑色素前体处理组与对照组蛹体壁着色和表皮截面特征;通过Illumina测序平台对黑色素前体处理组与对照组蛹体壁进行转录组测序,对差异表达基因(different expression genes,DEGs)进行GO功能分类和KEGG通路富集分析;分析被显著富集的基因注释和染色体分布;利用qRT-PCR验证转录组数据。【结果】多巴和多巴胺处理组中华按蚊蛹体壁与表皮截面相比于CK明显黑化,且多巴处理组着色程度最深;多巴和多巴胺处理组中华按蚊蛹表皮相比于CK明显增厚,且增厚程度与黑化程度相关。多巴处理组vs CK与多巴胺处理组vs CK比较组的DEGs分别为2952和697个,且下调基因居多;这两类比较组间共有上调的DEGs有223个,共有下调的DEGs有347个。DEGs的GO功能注释结果表明,在上述比较组以及两比较组间共有的上调DEGs被显著富集到表皮结构组分(GO:0042302)。KEGG通路富集分析结果显示,多巴处理组vs CK比较组上调的DEGs被显著富集到剪切体通路,下调的DEGs被显著富集到Toll-Imd和Hippo信号通路;在多巴胺处理组vs CK比较组中下调DEGs被显著富集到自噬通路;这两比较组间共享的DEGs没有被显著被富集的通路;65个被富集的上调表皮蛋白基因来自于CPR,CPF,TWDL,CPLC和CPAP 5个家族,并分布于3条染色体,其中部分成员成簇分布。qRT-PCR结果显示,两比较组中所选择的共有上调的12个表皮蛋白基因的表达量与转录组数据一致。【结论】本研究在组学水平上证实了蚊虫体壁组织中黑色素的过量累积能够诱导大量表皮蛋白基因的显著上调表达,并使得其表皮结构特征发生改变。研究结果为后续探索黑色素前体对表皮结构基因的调控机制,以及理解昆虫表皮重要组分间的互作模式,对昆虫适应性状的影响提供了新的视角。

中华按蚊CCE家族基因的表达模式分析

【目的】羧酸酯酶(carboxylesterases,CCEs)是一类重要的水解酶超家族,参与昆虫体内各种外源物质的代谢过程。本研究利用不同发育阶段、不同组织和吸血前后中华按蚊Anopheles sinensis的转录组数据分析CCE基因表达模式,为进一步研究CCEs在不同生理过程中的潜在功能奠定基础。【方法】以前期从中华按蚊实验室品系转录组数据库中筛选出的50个CCE基因,利用生物信息学分析其在中华按蚊不同发育阶段(卵、1-4龄幼虫、雄蛹、雌蛹、雄成蚊和雌成蚊)、成蚊不同组织(触角、唾液腺、中肠、马氏管、精巢、卵巢、表皮和脂肪体)中以及雌成蚊吸血前和吸血后不同时间(1,3,6,12,24和48 h)的表达模式。【结果】CCE基因主要在幼虫或成蚊阶段高表达或特异性表达;AsAe12,AsAe4和AsBe4在所有发育阶段均高表达。CCE基因的表达具有组织特异性,主要集中在成蚊触角、表皮和精巢中表达;此外,5个CCE基因(AsAe13,AsAe12,AsAe6,AsAe4和AsBe4)在成蚊中肠、马氏管和脂肪体中均高表达,可能与这些解毒器官代谢异生物有关。在雌成蚊吸血后,大多数CCE基因的表达量发生了变化,它们的表达模式也存在差异,这表明血液消化是一个复杂的过程。【结论】本研究结果丰富了中华按蚊CCE基因的知识,为深入探究CCE家族基因在中华按蚊生长发育中的的潜在功能提供有价值的参考。

疟疾媒介中华按蚊触角感器的扫描电镜观察

【目的】明确中华按蚊Anopheles sinensis雌成虫与幼虫触角感器的类型、形态和分布。【方法】利用光学显微镜观察中华按蚊成虫与幼虫触角的形态结构,利用扫描电镜观察触角上的感器类型、形态和分布。【结果】中华按蚊雌成虫触角由柄节、梗节和鞭节组成,鞭节有13个亚节。触角上共发现4种类型的感器,分别为毛形感器(锐型和钝型)、刺形感器(大型和小型)、锥形感器(Ⅰ型和Ⅱ型)和腔锥形感器(大型和小型)。雌成虫触角各类感器总计约1 135.67±86.75个,其中毛形感器数量最多(662.00±6.22个),随后是刺形感器(294.67±33.35个)和锥形感器(146.00±42.39个),腔锥形感器数量最少(36.50±5.90个)。毛形感器、刺形感器和锥形感器在鞭节的每个亚节均有分布,而大型腔锥形感器在第9-11亚节没有分布,小型腔锥形感器仅分布于第13节的顶端。幼虫触角的鞭节不分亚节,呈管状,触角末端有一个感觉锥,鞭节上分布有与成虫锥形感器相似的锥形凸起,初步定名为类锥形感器,其数量和大小随幼虫龄期的增长而显著增加,锥体表面的凹槽越来越明显,其功能还需要通过超微结构和电生理等研究进一步确定。【结论】本研究对中华按蚊幼虫和雌成虫触角感器的形态特征、类型、数量及其分布进行了观察和分析,结果为进一步研究中华按蚊感器的生理功能奠定了基础。

蚊科昆虫分类及区系研究历史和现状概述

蚊科昆虫是最重要的医学昆虫类群,是人类最致命的动物杀手。准确的蚊虫分类鉴定是媒介蚊虫基础研究和控制的基础。蚊科现代分类学研究起自于林奈1758年对库蚊属Culex种类的记述,200多年来,已定名的种类日渐增多,分类系统已基本成形。本文在系统地编制了蚊科昆虫的世界名录和地理分布记录的基础上,概述了世界范围内蚊科昆虫的分类研究历史,属级及以上类群的分类系统、种类及其生物学研究现状,并作了初步讨论和展望。目前,全球已知蚊虫41属201亚属3 573种,其中我国已知20属63亚属419种。按蚊亚科(Anophelinae)被认为是蚊科内单系类群,包括按蚊属Anopheles、白蚊属Bironella和沙蚊属Chagasia 3属11亚属489种。其中,按蚊属已知476种,占按蚊亚科已知种97%,是疟疾的单一传播媒介。库蚊亚科(Culicinae)被认为是一个复系类群,共计11族38属190亚属3 084种,系统发育关系尚未解决。伊蚊族(Aedini)、库蚊族(Culicini)、煞蚊族(Sabethini)和蓝带蚊族(Uranotaeniini)是其中的较大族,分别拥有1 262,800,432和270种。特别是库蚊属Culex、伊蚊属Aedes和曼蚊属Mansonia的许多种类是非常重要的医学媒介昆虫。在所有这些蚊虫种中,东洋区的种类最多,达1 075种;其次为新热带区(951种),非洲区(798种),澳洲区(542种),古北区(251种);新北区分布种类最少,有196种,不少种类跨区分布。这些信息有助于对世界范围内蚊科昆虫分类和分布现状的整体了解。由于隐存种(cryptic species)广泛存在,实际种数应是已定名种数的3~5倍。蚊科昆虫的系统分类对于蚊科昆虫的准确鉴定、基础生物学及蚊媒病传播机制研究、媒介蚊虫及蚊媒病控制都具有非常重要的理论和应用价值,蚊科昆虫的分类、系统发育和区系仍是急需要研究的重要课题。

武夷山国家级自然保护区夏季蛾类昆虫多样性调查及区系分析

2018-2019年7-9月份在武夷山国家级自然保护区选择不同的生境,通过网捕、黑光灯、日光灯诱集等方法进行蛾类昆虫样本采集,并对其进行标本制作和形态学鉴定,然后通过Menhinick指数对蛾类种类昆虫丰富度进行分析,并对采集到的蛾类昆虫种类组成和区系分布情况进行了总结.共鉴定蛾类昆虫标本370头,隶属于16科111属142种,其中福建省新纪录属10属和新纪录种12种,武夷山国家级自然保护区新纪录属11属和新纪录种28种.在物种多样性方面,尺蛾科在属级水平、种级水平、个体数上都占绝对优势,有23属27种67头,且丰富度指数最高,为3.30;鹿蛾科丰富度指数最低,为0.58.世界动物地理区系分析表明,该保护区蛾类昆虫的区系成分以东洋区和古北区共有种为主(占65.49%);中国动物地理区系分析表明,该保护区蛾类昆虫有29种分布型,主要以“西南—华中—华南—青藏”型分布为主(占19.01%),其次是“西南—华中—华南—华北—青藏”型(占18.31%).武夷山自然保护区蛾类昆虫种类具有多样性,物种丰富度较高.

重庆缙云山国家级自然保护区蝴蝶种类调查和区系分析

蝴蝶是重要的生态和观赏昆虫,重庆市缙云山国家级自然保护区的蝴蝶种类鲜见系统调查和研究。基于2012—2019年的野外系统调查及重庆师范大学昆虫标本馆馆藏蝴蝶标本,研究共获得缙云山国家级自然保护区蝴蝶标本569只,通过形态学鉴定,它们隶属于5科79属128种,其中重庆市新记录属2属和新记录种8种,缙云山国家级自然保护区新记录属5属和新记录种32种。这5科中,蛱蝶科的物种多样性最高,达到31属49种245只,其余依次为灰蝶科(20属27种118只)、弄蝶科(17属26种44只)、凤蝶科(5属16种65只)和粉蝶科(6属10种97只)。物种丰富度指数分析显示,弄蝶科的物种丰富度指数最高,达3.920,其余依次为蛱蝶科(3.130)、灰蝶科(2.486)、凤蝶科(1.985)和粉蝶科(1.015)。世界动物地理区系分析表明,该保护区蝴蝶的区系成分以东洋区和古北区共有种为主(占63.98%),其次是东洋区种类(占34.12%),世界广布种最少(仅占1.90%)。中国动物地理区系分析表明,保护区以跨西南—华南—华中的三区型分布为主(占27.01%),其次是跨西南—华中—华南—华北的四区型(占14.7%)。

基于年龄-龄期两性生命表分析阿维菌素对松褐天牛肿腿蜂的亚致死效应

【目的】阿维菌素是林业系统中常用的杀虫剂之一。该研究旨在探究阿维菌素对天敌昆虫——松褐天牛肿腿蜂Sclerodermus alternatusi的亚致死效应。【方法】采用微量点滴法,测定阿维菌素对松褐天牛肿腿蜂成蜂的毒力,并用亚致死剂量LD_(10)(3.20×10^(-5)μg/头)和LD_(30)(8.86×10^(-5)μg/头)阿维菌素处理松褐天牛肿腿蜂雌成蜂,测定其F_(1)代的发育历期、繁殖力、存活率及雌、雄成蜂寿命等参数的变化,并组建年龄-龄期两性生命表。【结果】与空白对照(未做任何处理)相比,LD_(10)和LD_(30)剂量阿维菌素处理均能显著缩短松褐天牛肿腿蜂雄成蜂寿命,但对卵、幼虫及蛹的历期无显著影响,但LD_(10)剂量阿维菌素处理还显著延长了松褐天牛肿腿蜂雌成蜂寿命。同时,LD_(10)和LD_(30)剂量阿维菌素处理下松褐天牛肿腿蜂F_(1)代雌成蜂的平均单雌产卵量较空白对照组分别升高了24.70%和64.56%。此外,F1代种群参数结果表明,LD_(10)和LD_(30)剂量阿维菌素处理使松褐天牛肿腿蜂平均世代周期(T)均显著延长,分别较空白对照组增加了7.01%和4.38%,但是对内禀增长率(r)与周限增长率(λ)无显著影响;LD_(10)剂量阿维菌素处理后松褐天牛肿腿蜂净增殖率(R_(0))较空白对照组显著增加。【结论】亚致死剂量的阿维菌素会抑制松褐天牛肿腿蜂后代的存活率,同时也能显著促进后代雌成蜂繁殖力,对后代种群增长无显著影响,阿维菌素是一个不影响天敌种群存活的较为理想的林业害虫防治药剂。

四种重要医学媒介蚊虫离子受体基因IR8a和IR25a的特征及分类地位

【目的】鉴定中华按蚊Anopheles sinensis、冈比亚按蚊Anopheles gambiae、埃及伊蚊Aedes aegypti和致倦库蚊Culex quinquefasciatus 4种重要医学媒介蚊虫的离子受体基因IR8a与IR25a以及代表性的iGluRs基因和IRs基因,研究这些基因的特征及其系统发育关系,确定IR8a与IR25a基因在离子谷氨酸受体基因中的分类地位。【方法】以黑腹果蝇Drosophila melanogaster的iGluRs和IRs基因序列作为询问序列,用BLASTP和BLASTN方法分别搜索中华按蚊、冈比亚按蚊、埃及伊蚊和致倦库蚊的基因组数据库,以鉴定这4个种内的iGluRs和IRs基因序列;用生物信息学方法比较分析鉴定获得的IR8a与IR25a及代表性的iGluRs和IRs基因氨基酸序列的特征;用最大似然法、贝叶斯法和最大简约法构建并讨论这些基因氨基酸序列的系统发育关系;用PAML软件计算这些基因的dN/dS(ω)值并分析其选择压力。【结果】通过对中华按蚊、冈比亚按蚊、埃及伊蚊和致倦库蚊中离子谷氨酸受体基因进行生物信息学鉴定,获得了所有IR8a和IR25a基因,24个代表性的iGluRs基因和30个代表性的IRs基因的序列。特征比较和系统发育关系分析结果表明,在4种蚊虫和黑腹果蝇中IR8a与IR25a基因的氨基酸序列长度与iGluRs的更接近,其平均值远大于其他IRs的;IR25a和IR8a有与传统iGluRs相同的氨基酸末端区域(amino-terminal domain,ATD),虽然IR8a的序列不太保守,而IRs则没有ATD;IR8a与IR25a序列有与传统iGluRs一样保守的配体结合区S1和S2,而IRs没有。所有这些基因的ω值远小于1,意味着这些基因在进化过程中都经历了纯化选择,而IR8a与IR25a的ω值更接近iGluRs。此外,IR8a与IR25a还有与non-NMDA相似的特异性位点,而这些位点在IRs不存在。再者,IR8a和IR25a与non-NMDA聚在一枝,形成一个姐妹群,群内序列间的遗传距离小于本研究中任何其他序列间的距离。根据这些研究结果,我们将IR8a与IR25a分类进入传统iGluRs中的non-NMDA类型,并命名为Putative受体。【讨论】本研究构建了蚊虫iGluRs和IRs基因的信息框架,确定了IR8a与IR25a基因的分类地位,对进一步的功能研究具有重要意义。

靛灰蝶和彩斑尾蚬蝶线粒体基因组及基于线粒体基因的凤蝶总科系统发育关系

【目的】对靛灰蝶Caerulea coeligena和彩斑尾蚬蝶Dodona maculosa线粒体全基因组进行测序和分析,并基于已知线粒体基因组数据探析凤蝶总科(Papilionoidea)的系统发育关系。【方法】利用Illumina NovaSeq 6000测序平台测定靛灰蝶和彩斑尾蚬蝶线粒体全基因组序列,对其进行拼装和注释,并对其tRNA基因二级结构进行预测;基于NCBI数据库中已报道的凤蝶总科6科48种蝴蝶线粒体基因组13个蛋白编码基因(protein-coding genes,PCGs)核苷酸序列,对凤蝶总科50个种的13个PCGs的选择压力进行分析;利用最大似然法(maximum likelihood,ML)和贝叶斯法(Bayesian inference,BI)分析这50个种及其所属科和亚科的系统发育关系。【结果】靛灰蝶和彩斑尾蚬蝶线粒体全基因组长分别是15164和15486 bp(GenBank登录号分别为MZ489120和MZ489121),其基因组大小、结构和组成、基因排列、核苷酸组成、密码子使用和tRNA结构预测等均与已知近缘种蝴蝶相似;凤蝶总科线粒体基因组进化经历了高水平的纯化选择,13个PCGs非同义替换率和同义替换率比值(K a/K s)明显小于1。凤蝶总科重建的系统发育关系为:(凤蝶科(Papilionidae)+弄蝶科(Hesperiidae)+粉蝶科(Pieridae)+(蛱蝶科(Nymphalidae)+(灰蝶科(Lycaenidae)+蚬蝶科(Riodinidae))))。【结论】基于凤蝶总科已报道的48种和本研究新测序两种线粒体基因组重建的系统发育树表明蚬蝶科与灰蝶科为单系且互为姐妹群关系,且与蛱蝶科具有更近的亲缘关系,凤蝶科可能是凤蝶总科中最早进化的类群。本研究为进一步研究蝴蝶的系统进化和完善其分类系统提供了新的分子数据支撑。

昆虫学家陈斌:勇攀科学高攀,献爱祖国振兴

对话陈斌1、当选俄罗斯自然科学院的外籍院士对您来说意味着什么?会为您以后的科研工作带来什么影响吗?陈:俄罗斯自然科学院1990年成立,1995年获联合国正式认可,2002年获联合国非政府组织地位,是俄罗斯三大科学机构之一。该院设有学部24个,现有18名诺贝尔奖获得者、270余名俄罗斯科学院院士及50余名其它科学院院士,外籍院士来自47个国家。

核受体基因SfUSP调控白背飞虱蜕皮发育

【目的】为探究核受体超气门蛋白(ultraspiracle protein, USP)在白背飞虱Sogatella furcifera若虫蜕皮发育过程中的功能及其与几丁质合成和降解之间的调控关系。【方法】基于白背飞虱基因组数据,结合RT-PCR克隆SfUSP全长cDNA序列;利用RT-qPCR测定白背飞虱不同发育阶段(1-5龄若虫、5龄若虫蜕皮前、5龄若虫蜕皮中和雌成虫)、5龄若虫组织(头、体壁、脂肪体、肠道和足)、雌成虫组织(体壁、翅、脂肪体、足和卵巢)以及100 ng/头20E处理后5龄第1天若虫中SfUSP的表达量;通过显微注射dsRNA靶向沉默5龄第1天若虫的SfUSP后,计算若虫存活率,观察若虫致死表型,利用RT-qPCR测定几丁质合成和降解通路关键基因的表达量。【结果】克隆获得了白背飞虱SfUSP(GenBank登录号:ON209396)的全长cDNA序列,其开放阅读框长1 263 bp,编码420个氨基酸,SfUSP蛋白预测分子量为47.27 kD,理论等电点为7.18。序列分析结果表明,SfUSP含有核受体家族所具备的5个保守结构域,并且DNA结合域(DNA-binding domain, DBD)和配体结合域(ligand-binding domain, LBD)高度保守。发育阶段表达谱表明,SfUSP在1龄若虫、5龄若虫蜕皮前以及雌成虫中高表达;组织表达谱显示,SfUSP在5龄若虫头、体壁、脂肪体和肠道中的表达量较高;在雌成虫翅、足和体壁中的表达量较高。显微注射100 ng/头20E后12 h时,5龄若虫中SfUSP的表达量显著高于对照组的。靶向沉默SfUSP表达后,与注射dsGFP的对照组相比,显著降低了白背飞虱的若虫存活率,显微注射dsRNA 6 d时若虫存活率仅为对照组的18.01%,其中不能成功蜕皮个体占51.46%;显著抑制了几丁质合成通路关键基因SfCHS1,SfCHS1a,SfUAP,SfGFAT和几丁质降解通路关键基因SfCht7,SfNAG1,SfNAG2,SfCDA1,SfCDA2和SfCDA4的表达量,但是显著提高了SfG6PI和SfCht10的表达量。【结论】SfUSP是白背飞虱生长发育过程中的关键基因,能够影响几丁质的合成与降解,进而调控白背飞虱的蜕皮发育。

土蜂科线粒体基因组序列测定和分析

【目的】本研究旨在通过针尾部(Aculeata)昆虫线粒体基因组系统发育分析认知土蜂科(Scoliidae)的单系性及系统发育位置。【方法】利用Illumina Hiseq2500二代测序技术测序土蜂科3属5种的线粒体基因组,并进行注释和分析;基于针尾部昆虫36个线粒体基因组13个蛋白质编码基因(protein-coding genes,PCGs)和2个rRNA基因序列采用最大似然法(maximum likelihood,ML)和贝叶斯法(Bayesian inference,BI)法构建系统发育树。【结果】新测序的土蜂科5个线粒体基因组为五带波壁土蜂Colpa quinquecincta线粒体基因组(GenBank登录号:OM103696),齿石波壁土蜂Colpa tartara线粒体基因组(GenBank登录号:OM103697),厚大长腹土蜂Megacampsomeris grossa线粒体基因组(GenBank登录号:OM103796),台湾大长腹土蜂Megacampsomeris formosensis线粒体基因组(GenBank登录号:OM142776)和斯式土蜂Scolia schrenkii线粒体基因组(GenBank登录号:OM103797),其长度范围为15367~20649 bp,包含37~39个基因[13个PCGs、2个rRNA基因(rrnL和rrnS)和22~24个tRNA基因],AT含量均在75%以上;13个PCGs的起始密码子均为ATN,终止密码子为TAA或T--;与推测的祖先序列不同,新测序的土蜂科5个线粒体基因组出现了复杂的基因重排事件,其主要是基因区trnS1-trnE-trnF-nad5-trnH中一些基因位置的改变和基因区trnI-trnQ-trnM-nad2-trnW-trnC-trnY-cox1-trnL2-cox2-trnK发生的异位倒置,此外,trnF,trnS1,trnE,trnH和nad5基因的位置也发生了改变;13个PCGs的Ka/Ks和核苷酸多样性π均表明cox1是最保守的基因;ML树和BI树的结果均显示土蜂科为单系群,土蜂科与蛛蜂科(Pompilidae)互为姐妹群关系,土蜂科中Colpa属和Scolia属以及Megacampsomeris属和Camposmeris属都表现出了较近的亲缘关系。【结论】本研究初步鉴定了土蜂科线粒体基因组的特征,为进一步的研究奠定了基础,基于线粒体基因组的系统发育分析显示土蜂科是一个单系。

阿维菌素对白背飞虱发育和繁殖的亚致死效应

【目的】探究阿维菌素对白背飞虱Sogatella furcifera的亚致死效应。【方法】采用稻茎浸渍法,分别以阿维菌素亚致死浓度LC10(0.016 mg/L)和LC25(0.031 mg/L)处理白背飞虱3龄若虫,统计F0代雌雄成虫寿命、单雌产卵量;记录F1代的发育历期、繁殖力、存活率及雌雄成虫寿命、内禀增长率(r)、周限增长率(λ)、净增殖率(R0)和平均世代周期(T),组建年龄-阶段两性生命表。【结果】与对照(蒸馏水)相比,白背飞虱3龄若虫在LC10和LC25浓度阿维菌素的胁迫下,F0代单雌产卵量均显著降低,但孵化率未受影响;LC25浓度阿维菌素处理后,白背飞虱雄成虫寿命与对照组相比显著延长,但LC10阿维菌素处理显著缩短了雌成虫寿命。在F1代中,LC10和LC25浓度处理组的单雌产卵量分别为170.64和155.79粒,显著低于对照组的(193.38粒)。同时,LC10和LC25浓度处理组F1代内禀增长率(r)、周限增长率(λ)以及平均世代周期(T)均略低于对照组,而净增殖率(R0)与对照组相比有下降趋势,但差异不显著。【结论】亚致死浓度阿维菌素胁迫能够在一定程度上抑制白背飞虱后代种群的增长。

中华按蚊中基于卵巢导向肽和Gal4-UAS结合特性的外源DNA投递系统构建

【目的】利用P2C可以定向进入卵巢以及Gal4蛋白可与UAS序列稳定结合的特点,在中华按蚊Anopheles sinensis中建立高效的非胚胎期外源DNA投递技术系统。【方法】注射P2C-Gal4-DsRed重组蛋白至吸血后20 h时的中华按蚊雌成蚊腹部,通过冰冻切片荧光观察和Western blot检测分析重组蛋白P2C-Gal4-DsRed在卵巢中的投递效率;制备P2C-Gal4 DNA BINDING重组蛋白,构建包含12×UAS重复基序的转基因质粒和辅助质粒,通过电泳迁移实验分析重组蛋白P2C-Gal4 DNA BINDING和12×UAS重复基序间的体外结合;分别将体外孵育的P2C-Gal4 DNA BINDING+辅助质粒ITF36-12×UAS和P2C-Gal4 DNA BINDING+转基因质粒ITF2-12×UAS afm复合物注射入吸血后20 h时的中华按蚊雌成蚊腹部,于血餐后40 h时提取其卵巢组织DNA,并通过特异性引物PCR扩增和测序分析外源DNA在活体中的投递情况。【结果】100%注射P2C-Gal4-DsRed的中华按蚊雌成蚊卵巢在绿色滤光片下呈现明显的红色荧光,表明P2C-Gal4-DsRed重组蛋白能够被高效地导入雌成蚊卵巢中;P2C-Gal4 DNA BINDING重组蛋白能够与12×UAS重复基序以及含有该重复基序片段的质粒稳定结合;分别有91%和93%的注射了P2C-Gal4 DNA BINDING+ITF36-12×UAS和P2C-Gal4 DNA BINDING+ITF2-12×UAS afm的雌成蚊卵巢组织中能够检测到外源DNA片段。【结论】在中华按蚊中成功建立了基于P2C卵巢导向肽和Gal4-12×UAS重复基序结合特性的外源DNA投递技术体系;通过此技术平台能够便捷、快速和高效地实现质粒等DNA分子在中华按蚊卵巢中的投递,这为进一步简化转基因、过表达及基因敲入等遗传操作奠定了基础。

中华按蚊AsCYP9 J5参与对溴氰菊酯的抗性

【目的】研究中华按蚊Anopheles sinensis细胞色素P450基因AsCYP9J 5是否与溴氰菊酯抗性有关。【方法】PCR克隆中华按蚊AsCYP9J 5的开放阅读框并进行生物信息学分析。采用RT-qPCR检测AsCYP9J 5在中华按蚊溴氰菊酯敏感品系(WX-LS)和抗性品系(YN-LR和CQ-LR)雌蛹和雌成蚊以及WX-LS雌蛹头、胸、腹部前3节(腹部前端)、腹部剩余部分(腹部后端)和25 mg/mL溴氰菊酯诱导体外培养的雌蛹头中的表达量。基于上述AsCYP9J 5表达量,于YN-LR和CQ-LR化蛹后20 h时雌蛹头部注射ds AsCYP9J 5和ds EGFP进行RNAi,采用RT-qPCR检测成蚊中AsCYP9J 5的表达量,统计溴氰菊酯处理后成蚊半数击倒时间(half knockdown time,KT 50)、击倒率和死亡率。通过分子对接模拟预测AsCYP9J5与溴氰菊酯相互作用的氨基酸残基。【结果】克隆获得AsCYP9J 5开放阅读框,全长1626 bp,编码541个氨基酸,无信号肽和跨膜结构域。AsCYP9J 5在YN-LR和CQ-LR不同发育阶段表达量不同,化蛹末期至羽化后9 h在YN-LR中的表达量显著高于在WX-LS中的,在化蛹后30 h至羽化后72 h期间CQ-LR中高表达,各发育阶段(化蛹后20 h除外)CQ-LR中的表达量均显著高于在WX-LS中的;AsCYP9J 5在WX-LS雌蛹头部的表达量最高,其次是在胸部,而在腹部前端和腹部后端的表达量接近并最低。溴氰菊酯诱导12 h时WX-LS雌蛹头部AsCYP9J 5的表达量比对照组上调了11倍,诱导24 h时AsCYP9J 5的表达量略低于对照组。与注射ds EGFP的对照组相比,注射ds AsCYP9J 5的YN-LR和CQ-LR处理组成蚊AsCYP9J 5的表达量分别下调了约68%和38%,分别约提前10和20 min出现明显的击倒现象,击倒率明显升高,死亡率分别增加了28.6%和24.0%,表明沉默AsCYP9J 5导致中华按蚊对溴氰菊酯的敏感度显著增加。分子对接模拟结果显示,溴氰菊酯可以进入AsCYP9J5的结合口袋,并且与Arg-488形成二元的Pi-阳离子相互作用,与AsCYP9J5的Phe-109发生稳定的T型Pi-Pi叠合,与Cys-348和Thr-344形成Pi-硫与Pi-孤对电子相互作用,侧链可以与AsCYP9J5的Gln-224形成稳定氢键相互作用,也可以与Ile-227,Leu-413和Lys-53形成稳定的疏水相互作用网络。【结论】本研究结果表明AsCYP9J 5参与中华按蚊溴氰菊酯抗性表型的维持,这为进一步探究该基因编码的蛋白酶代谢溴氰菊酯的分子机理奠定了前期基础。

赭翅臀花金龟线粒体全基因组测序及分析

【目的】测定和分析赭翅臀花金龟Campsiura mirabilis线粒体全基因组,并基于线粒体基因组序列探讨金龟科(Scarabaeidae)的系统发育关系。【方法】采用Illumina Hiseq X Ten测序平台,首次测定了赭翅臀花金龟的线粒体全基因组序列,并对其基因结构特点和碱基组成进行分析。结合GenBank中已公布的金龟科54个种的线粒体基因组序列,对该科共55个种线粒体蛋白质编码基因(protein-coding genes,PCGs)的选择压力进行了分析;并基于PCGs和rRNA基因序列,选取锹甲科(Lucanidae)的美国深山锹Lucanus mazama作为外群分别使用最大似然法(maximum likelihood method,ML)和贝叶斯法(Bayesian inference,BI)构建金龟科的系统发育树。【结果】赭翅臀花金龟的线粒体基因组(GenBank登录号:MT548771)全长16123 bp,包括13个PCGs、22个tRNA基因、2个rRNA基因和一个D-loop区(控制区),没有发现基因重排现象;22个tRNA基因中除trnS1缺失DHU臂,其余均可形成典型的三叶草式二级结构。赭翅臀花金龟线粒体基因组的碱基组成具有AT偏好性,全基因组的AT-skew大于0,GC-skew小于0。金龟科线粒体基因组的PCGs的K_(a)/K_(s)值都低于1,表明这13个PCGs都经历了纯化选择。基于线粒体基因组13个PCGs和2个rRNA基因序列的金龟科的系统发育关系为((蜉金龟亚科(Aphodiinae)+金龟亚科(Scarabaeinae))+(鳃金龟亚科(Melolonthinae)+(花金龟亚科(Cetoniinae)+(丽金龟亚科(Rutelinae)+犀金龟亚科(Dynastinae)))))。【结论】本研究测定和分析了赭翅臀花金龟的线粒体基因组,并分析了金龟科的系统发育关系,结果显示金龟亚科、花金龟亚科、丽金龟亚科、犀金龟亚科和鳃金龟亚科均为单系群。

野生中华按蚊共生微生物群落与杀虫剂抗性关系

【目的】探讨野生环境下不同地区中华按蚊Anopheles sinensis共生微生物群落与杀虫剂抗性的关系。【方法】采集分别来自中国重庆、云南和安徽野生中华按蚊雌成虫,采用WHO标准体外生物测定法和0.05%拟除虫菊酯类试验纸,对中华按蚊雌成虫进行拟除虫菊酯类药敏试验,获得杀虫剂敏感(FS)和杀虫剂抗性(FR)的中华按蚊雌成虫并通过Illumina Hiseq 2000平台进行全基因组高通量测序,比对16S rRNA和18S rRNA基因序列鉴定杀虫剂敏感和杀虫剂抗性中华按蚊共生微生物,并进行α多样性分析、β多样性分析、聚类分析、主坐标分析(principal coordinates analysis,PCoA)和共生微生物群落差异分析。【结果】从来自重庆、云南和安徽FS和FR野生中华按蚊雌成虫中鉴定到共生微生物3284种,分属14门52属。安徽FR野生中华按蚊雌成虫共生微生物多样性差异及群落丰富度最高,重庆FS野生中华按蚊雌成虫的最低。野生中华按蚊雌成虫共生微生物群落首先按地区聚类,其中重庆和云南野生中华按蚊共生微生物群落多样性更相似。FR野生中华按蚊雌成虫共生微生物中10株细菌丰富度更高,包括2株蓝细菌属Cyanobacteria细菌、3株盐杆菌目(Halobacteria)细菌、1株赭黄嗜盐囊菌属Haliangium细菌、3株瘤胃菌科(Ruminococcaceae)细菌和1株链球菌属Streptococcus细菌。【结论】野生中华按蚊共生微生物群落具有地区差异性和抗性差异性,鉴定到的共生微生物对于中华按蚊杀虫剂抗性可能起到积极作用,研究结果为揭示中华按蚊杀虫剂抗性提供思路。

基于转录组数据的中华按蚊细胞色素P450超家族基因不同发育阶段、成蚊不同组织和吸血前后不同时期雌成蚊的表达模式分析

【目的】本研究以中华按蚊Anopheles sinensis细胞色素P450超家族基因为研究对象,分析其在中华按蚊不同发育阶段、成蚊不同组织和雌成蚊吸血前后不同时期的表达模式,为进一步研究其功能奠定基础。【方法】收集中华按蚊实验室溴氰菊酯敏感品系(WX-LS)不同发育阶段(卵、1-4龄幼虫、雄蛹、雌蛹、雄成蚊和雌成蚊)、成蚊组织(触角、唾液腺、中肠、马氏管、精巢、卵巢、表皮和脂肪体)和雌成蚊吸血后1,3,6,12,24和48 h时的样本,采用Illumina HiSeqTM2000进行转录组测序。基于测得的转录组数据,分析细胞色素P450基因在中华按蚊不同发育阶段、成蚊不同组织及吸血前后雌成蚊中的表达量。【结果】中华按蚊细胞色素P450超家族基因的表达具有发育阶段特异性和组织特异性。在幼虫、蛹和成虫期,分别有40,26和35个基因表达量较高,其中CYP6AG1,CYP6AG2,CYP6AH1,CYP6Z3,CYP6Y2,CYP6P4,CYP9J3和CYP9J4在整个幼虫期高表达。中华按蚊CYP6AA1,CYP6AH1,CYP6M4,CYP9J3,CYP9J4和CYP12F3在成蚊中肠和马氏管中均高表达,CYP4G16,CYP6AA1,CYP6AH1,CYP6Y1,CYP6Z3,CYP9J3和CYP9J4在成蚊所有组织中均表现出高表达。CYP4G16,CYP6AA1,CYP6AG2,CYP6AH1,CYP6Y1,CYP6Y2,CYP9K1,CYP12F3和CYP304B1在中华按蚊雌成蚊吸血后1,3,6,12,24和48 h时均高表达。【结论】在幼虫期高表达的细胞色素P450超家族基因可能参与了对幼虫期食源性有毒化合物质的解毒,在雌成蚊中肠和马氏管中高表达的细胞色素P450基因可能在解毒过程中发挥了重要作用。研究结果为进一步探究细胞色素P450超家族基因在中华按蚊生长发育、表达调控和杀虫剂代谢机制等方面的功能奠定了前期基础。

重庆市城口县食蚜蝇科(双翅目)昆虫的分类和区系分析

【目的】调查重庆市城口县双翅目(Diptera)食蚜蝇科(Syrphidae)昆虫的种类并进行区系分析。【方法】在城口县所辖全部25个乡(镇、街道)内用样线法、灯诱法、马来氏网法等系统地开展了食蚜蝇科昆虫调查;对所有标本开展了形态学鉴定和物种描述;编制了分种检索表,并进行了区系分析。【结果】采集和检视了城口县食蚜蝇科的昆虫标本共400余头;经鉴定,它们分属2亚科、6族、10属、13种,其中3族、6属、9种为城口县新纪录族、属、种。城口县的食蚜蝇科昆虫具有东洋界和古北界的成分,但以东洋界的成分占主体;而它们在中国动物地理区系中具有9种不同的物种区系分布型,所有记述的种类都分布于东洋界的华中区和古北界的华北区。【结论】研究结果有助于城口县食蚜蝇科昆虫的正确鉴定、保护和利用。

意大利蜜蜂幼虫防御素Defensin-2在吡虫啉胁迫下的表达分析

防御素在昆虫免疫抵抗农药危害中具有重要作用,但蜜蜂防御素Defensin在幼虫抵御吡虫啉毒性中的作用鲜有报道。生物信息学鉴定意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica防御素Defensin-2,分析其在吡虫啉暴露下蜜蜂幼虫中的表达模式,探讨其在幼虫抵御吡虫啉中的作用。生物信息学方法分析Defensin-2的氨基酸序列特征、功能域、高级结构、互作靶标、系统进化聚类关系;RT-qPCR分析幼虫口服暴露吡虫啉后Defensin-2基因的表达特征。结果显示,Defensin-2蛋白由104个氨基酸残基组成,相对分子质量为11.9 kDa,等电点PI为8.54,具有信号肽和跨膜结构域。多重序列比对显示Defensin-2属于防御素样超家族。系统进化分析表明,Defensin-2聚类于蜜蜂家族;RT-qPCR分析表明,在半致死浓度吡虫啉暴露下,Defensin-2基因在24 h时显著上调表达后在72 h时下调表达,但在环境浓度吡虫啉暴露后72 h,Defensin-2表达量呈显著上调。Defensin-2可能在意大利蜜蜂幼虫抵御吡虫啉毒性中发挥着重要作用。