快速深低温冻存对新生大鼠卵巢组织免疫原性的影响

目的:探讨快速冻存法冻存新生大鼠卵巢器官的效果,以及冻存对卵巢抗原性的影响。方法:采用快速冻存法冻存出生1 d的鼠(新生鼠)卵巢组织,移植入同系去卵巢成年雌性大鼠的肾被膜下,利用免疫组织化学方法及Western blot检测观察移植物内CD8+和CD4+T淋巴细胞的浸润情况。结果:新生鼠卵巢组织移植后动情周期恢复率(66.67%)低于新鲜移植组(90.51%),但无显著性差异。各移植物内毛细血管丰富;有正常发育阶段的各级卵泡、间质腺及闭锁卵泡;CD8+和CD4+阳性细胞计数值及其蛋白表达明显低于新鲜移植组。结论:快速冻存法可有效地冻存新生鼠的卵巢;冻存降低新生鼠卵巢组织抗原性。

两种方法冻存胎儿卵巢组织后的活力判断

目的比较常规慢速冻存法与快速冻存法保存胎儿卵巢组织的效果,为快速冻存法的应用提供依据。方法以1.5 mol/L乙二醇与0.1 mol/L蔗糖作冷冻保护剂,分别采用常规慢速冻存法和三步快速冻存法保存1 mm3大小的胎儿卵巢组织,解冻后观察两组卵巢组织内的超微结构;以去势裸鼠为受体,将解冻后的胎儿卵巢皮质片移植于裸鼠的双肾被膜下,观察移植2周和8周后移植物的组织学结构、移植物存活率、卵泡密度及受体鼠血清E2水平。结果与新鲜胎儿卵巢组织相比,慢速和快速冷冻后卵巢组织中形态正常的卵母细胞的比例都明显减少(P<0.05)。移植后2周的两移植组均有卵泡存活,原始卵泡广泛分布于基质中;移植后8周的两移植组的卵泡数量都明显减少,但初级卵泡的数量相对增加。比较移植2周和8周后移植物的存活率、单位面积移植物内的原始卵泡或初级卵泡数及受体鼠血清雌激素水平,两移植组并无显著性差异。结论三步快速冻存法可有效保存胎儿卵巢组织的生物活性,解冻后卵巢组织的形态学结构、雌激素分泌与常规慢速冻存组并无显著性差异。

β-巯基乙醇对培养胎儿卵巢组织异种移植效果的研究

目的探讨β-巯基乙醇(β-ME)对体外培养的卵巢组织的保护作用,寻找提高胎儿卵巢组织异种移植存活率的有效方法。方法取中晚期引产的死亡女胎,分别进行新鲜移植(对照组)或将卵巢组织在不含β-ME(培养对照组,β-ME0)、含100μMβ-ME(培养组,β-ME100)的培养液中新鲜培养3d后移植到裸鼠体内,从动情周期的恢复情况、组织学变化等方面比较各组移植物的活力。结果(1)β-ME0、β-ME100及对照组裸鼠动情周期的恢复率分别是62.5%、87.5%和33.3%,β-ME100组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。β-ME0、β-ME100组和对照组移植后动情周期开始天数为(25.20±4.49)d、(23.5±5.79)d和(12.75±1.5)d,两培养组均明显长于对照组(P<0.05);(2)异种移植后的组织学观察可见到存活移植物内有不同发育阶段的卵泡;卵泡计数β-ME100组(16.4±3.7815个/高倍视野)与对照组(4.0±2.8000个/高倍视野)比较差异有统计学意义,P<0.05。结论胎儿卵巢组织异种移植后卵泡可继续发育,经培养可提高移植物的活力,β-ME有利于提高移植物的存活率,促进卵泡的发育。

胎儿卵巢组织玻璃化冻存效果的研究

目的探讨玻璃化冻存法对胎儿卵巢组织形态和功能的保存效果。方法采用改良EG5.5/30玻璃化液冻存胎儿卵巢皮质片,解冻后观察卵巢组织学变化,卵巢皮质片异种异位移植后,观察受体鼠动情周期恢复率、恢复时间、卵泡发育状况。结果实验组与新鲜培养后移植组、添加抗氧化剂培养后移植组相比动情周期恢复率差异无统计学意义(P>0.05),但高于新鲜移植组(P<0.005);动情周期恢复需要的天数接近于新鲜移植组,明显短于两种培养组(P<0.05);在卵泡计数上,实验组每高倍视野的卵泡计数明显高于新鲜移植组(P<0.005),与培养后移植组间的差异无统计学意义(P>0.05)。移植后18周,组织学观察见大量窦卵泡,而培养组仅偶见窦卵泡。结论玻璃化冻存法可有效冻存胎儿卵巢组织,且不影响卵泡继续发育的潜能。

四氯化碳所致肝损伤自愈过程中颌下腺颗粒曲管细胞的组织学及组织化学变化

将大鼠随机分为ＣＣｌ４损伤组（实验组）、实验对照组及正常对照组，在损伤后２、４、８、１２ｄ取颌下腺进行组织学及组织化学染色。结果表明：肝损伤后颌下腺颗粒曲管（ＧＣＴ）第４～８ｄ变化明显。ＨＥ、Ｍａｌｏｒｙ染色及ＰＡＳ反应４ｄ时阳性反应颗粒增多，脱颗粒现象明显。第８ｄ阳性反应颗粒略少，脱颗粒现象仍很明显，第１２ｄ趋于正常。提示颌下腺颗粒曲管细胞的变化与ＣＣｌ４所致肝损伤的再生。

体外受精-胚胎移植91个周期妊娠结局分析

目的对体外受精-胚胎移植(IVF-ET)91周期妊娠率影响因素进行分析。方法对本中心2003年9月至2005年10月进行体外受精/卵胞浆内单精子注射-胚胎移植(IVF/ICSI-ET)的91个周期的资料进行整理,用方差分析和χ2检验进行统计学处理。结果①不孕病因之间及不孕时间的长短对妊娠率无显著性影响;②35岁以下组的成熟卵数、受精卵数、卵裂数、优质胚胎数也多于35岁以上组,组间差异显著;获卵数和移植胚胎数均多于35岁以上组,组间差异非常显著;大于35岁年龄段的妊娠率较低,但无统计学意义;③妊娠与未妊娠组患者的受精卵数、优质胚胎数有显著性差异,而平均年龄、获卵数、成熟卵数、卵裂数和内膜厚度无显著性差异;④IVF+ICSI受精周期的ICSI受精率、卵裂率和优质胚胎率均明显优于IVF,存在非常显著性差异;IVF+ICSI周期的临床妊娠率57.1%。结论年龄是影响获卵数、成熟卵数、受精卵数、卵裂数以及优质胚胎数的最主要因素;卵子质量是影响周期妊娠率的关键因素;IVF+ICSI受精是预防和应对IVF受精不良或不受精、提高妊娠率行之有效的方法。

传统及改良冻存法对人胎肝细胞保护效果的比较

目的:比较传统及改良冻存法对人胎肝细胞保护效果,建立一种适合于人胎肝细胞冷冻保存的方法。方法:实验于2006-07/11在广州医学院进行。①人胎肝组织取自中期终止妊娠胎儿(20周,经胎儿亲属知情同意及医院伦理委员会批准)。冷冻保护液包括A液(DMEM培养液含1.5mol/L乙二醇+体积分数为0.2胎牛血清);B液(A液+0.1mol/L蔗糖)两部分。②传统冻存法:用0.025%Ⅰ型胶原酶消化胎肝组织,分离、收集消化后的胎肝细胞。胎肝细胞在A液、B液中分别渗透平衡20min后,在冷冻保护B液中经液氮蒸汽冷平衡5min后迅速入液氮冻存,1周后复苏培养观察。③改良冻存法:胎肝组织在A液、B液中分别渗透平衡20min后,在冷冻保护液B液中经液氮蒸汽冷平衡5min后迅速入液氮冻存,1周后复苏,入DMEM培养液37℃孵育1h,胶原酶消化胎肝组织,分离、收集消化后的胎肝细胞培养观察。④新鲜分离的胎肝细胞做为对照组。⑤复苏后分离所得胎肝细胞用锥虫兰染色评估细胞活率,并记录贴壁时间,观察集落生长情况。结果:①锥虫兰染色结果显示传统冻存法复温后的胎肝细胞活率为(73.8±2.2)%,明显低于新鲜分离的胎肝细胞活率(89.2±3.6)%及改良冻存法所得胎肝细胞活率(82.5±4.2)%(P<0.01)。②贴壁情况观察发现新鲜胎肝细胞与改良冻存法胎肝细胞于培养24h开始贴壁,而传统冻存法胎肝细胞贴壁时间滞后48h。③新鲜胎肝细胞及改良冻存法胎肝细胞于第3天出现生长集落(细胞数>10为一个集落),传统冻存法胎肝细胞在第5天出现生长集落,集落的数量低于改良冻存法及对照组(P<0.01)。结论:改良冻存法可避免冻存前损伤,提高细胞对冷冻的耐受性和冻存复温后细胞的活率。

乙二醇、丙二醇对胎儿卵巢冻存效果的影响

目的比较1.5mol/L的乙二醇和丙二醇两种低温保护剂对胎儿卵巢组织的保存效果。方法采用“一步降温法”对24～28周水囊引产的胎儿卵巢进行冻存,将解冻后的胎儿卵巢组织移植于去势裸鼠的双肾被膜下,分别于移植后2、4及8周取材,通过电镜观察及移植后的组织学、受体鼠血清雌激素水平测定和阴道脱落细胞涂片判断组织细胞活性。结果乙二醇对卵泡形态结构的保存优于丙二醇,后者在卵巢的部分区域可见不可逆性的冷冻损伤;乙二醇组动情周期恢复率为33.3%,移植后动情周期开始天数为(15.00±5.0)d,而丙二醇组动情周期恢复率为16.7%,移植后动情周期开始天数(23.50±6.26)d。移植2周后乙二醇组与丙二醇组的移植物存活率分别为83.3%、66.7%,两组受体鼠血清雌激素水平之间的差异具有统计学意义(P<0.05),异种移植8周后两组移植物的存活率分别为58.3%、33.3%。结论以1.5mol/L的乙二醇作低温保护剂行快速冷冻效果优于1.5mol/L的丙二醇。

固定剂、封片剂、温度及除菌方式对量子点标记细胞的影响

目的:观察不同固定剂、封片剂、温度及除菌方式对3种量子点标记小鼠腹腔巨噬细胞和正常皮肤的影响。方法:利用发射波长为610、523和576nm的3种量子点,以具有吞噬能力的小鼠腹腔巨噬细胞及正常皮肤为载体,观察不同的固定剂、封片剂、温度及除菌方式对量子点标记细胞及组织的影响。结果:3种量子点对小鼠腹腔巨噬细胞和皮肤组织没有明显的毒性,并且在6～72h内保持荧光不衰减。高于56℃的温度会使量子点失去发射荧光的特性。较好的除菌方式为^(60)Co照射和微孔滤膜过滤。最稳定的封片剂为水溶性的ClearmountTM。吞噬了量子点523的巨噬细胞,可使用多种固定液固定。结论:不同波长量子点标记小鼠腹腔巨噬细胞和皮肤组织的效能受固定剂、封片剂、温度和除灭菌方式的影响。

固定剂、封片剂、温度及除菌方式对量子点标记细胞的影响

为了为利用量子点标记细胞、组织，进一步研究其功能提供新的方法，本实验观察了3种发射波长的量子点（quautum dost，QDs）对所标记的小鼠腹腔巨噬细胞和正常皮肤的影响。利用发射波长610mm的红色荧光水溶液（量子点610）、发射波长为523mm的绿色荧光水溶液（量子点523）和发射波长576nm的黄色荧光脂溶性溶液（量子点576）的3种量子点（5mg／ml）以及具有吞噬能力的小鼠腹腔巨噬细胞、正常皮肤为载体，观察不同的除菌方式、温度、封片剂及固定剂对量子点标记细胞、组织的影响，为量子点在生物体内的应用及在生物制片过程中对其性能的影响等研究奠定基础。

量子点对体外培养细胞影响的实验观察

目的观察量子点(QDs)对体外培养细胞的影响。方法选用小鼠巨噬细胞、人肝癌Bel-7402细胞株进行体外培养并实验,设空白对照组和5个剂量实验组,QDs终浓度为3.125、6.25、12.5、25和50μg/mL,采用MTT法观察QDs作用体外培养细胞后细胞成活情况,于酶标仪上测定OD值,并以均数进行F检验。结果量子点浓度小于6.25μg/mL时,实验组与对照组OD值比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论量子点在一定剂量内不影响体外培养细胞的生长。