结核分枝杆菌H37Ra感染的THP-1细胞TGF-β1、Smad2、Smad3、TNF-α、IL-6 mRNA表达变化

目的观察结核分枝杆菌H37Ra在不同感染复数及不同感染时间感染的THP-1细胞内TGF-β1/Smad2、3信号通路活化以及炎症因子TNF-αmRNA、IL-6 mRNA的表达变化,明确TGF-β1/Smads经典信号通路的激活程度是否与结核分枝杆菌感染的细菌量有关以及在结核分枝杆菌感染后的哪个时间阶段发挥主要作用。方法培养THP-1巨噬细胞及结核分枝杆菌H37Ra,建立H37Ra在相同时间点(感染24 h)不同感染复数(MOI=0、1、10、100)和在MOI=10,不同感染时间点(T=0 h、6 h、12 h、24 h)感染THP-1细胞的感染模型;用qRT-PCR检测不同感染复数及不同感染时间THP-1细胞中TGF-β1 mRNA、Smad2 mRNA、Smad3 mRNA、TNF-αmRNA、IL-6 mRNA。结果H37Ra感染24 h时,与空白对照比较,当MOI=1、10、100时,TGF-β1 mRNA的相对表达量先升高后降低,在MOI=10时表达最高(P<0.05);Smad2 mRNA的相对表达量降低(P<0.05);Smad3 mRNA相对表达量升高(P<0.05);TNF-αmRNA和IL-6 mRNA表达变化趋势基本一致,在MOI=1、10时升高不明显(P>0.05),MOI=100时升高(P<0.05)。H37Ra MOI=10时,随感染时间(T=6 h、12 h、24 h)延长,TGF-β1 mRNA的相对表达量呈现升高趋势(P均<0.05);Smad2 mRNA的相对表达量呈降低趋势(P<0.05);Smad3 mRNA相对表达量呈先升高后降低趋势,在T=6 h最高(P<0.05);TNF-αmRNA和IL-6 mRNA表达变化趋势基本一致,呈先升高后降低趋势,在T=12 h时最高(P<0.05)。结论相同感染时间,随着MOI值增加,结核分枝杆菌H37Ra感染的THP-1巨噬细胞中TGF-β1 mRNA表达先上调后降低,Smad2 mRNA表达下调,Smad3 mRNA表达上调,TNF-αmRNA、IL-6 mRNA相对表达量在MOI=100时升高;MOI=10时,随着感染时间延长,结核分枝杆菌H37Ra感染的THP-1巨噬细胞中TGF-β1 mRNA相对表达量升高,Smad2 mRNA表达下调,Smad3 mRNA表达先升高,6 h后降低,TNF-αmRNA和IL-6 mRNA表达早期上调,12 h后降低。结核分枝杆菌感染的细菌量与TGF-β1/Smads经典信号通路的激活程度有关,结核分枝杆菌感染后的12 h内TGF-β1/Smads经典信号通路发挥主要作用。

脊柱结核椎间盘LncRNA表达差异性分析及潜在诊断标志物筛选

目的:应用表达谱芯片检测脊柱结核(spinal tuberculosis,STB)患者椎间盘中差异表达的长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)及mRNA,并筛选有诊断标志物潜力的LncRNA。方法:从2018年9月~2020年12月于宁夏医科大学附属总医院脊柱骨科就诊的患者中选取STB患者(实验组)及脊柱退变患者(对照组)各28例。收集两组患者病变椎间盘并提取总RNA,两组各挑选3例合格标本通过Arraystar人类LncRNA V5.0版芯片进行检测并进行芯片数据处理计算各RNA的差异倍数(fold change,FC),其中FC≥2的LncRNA及mRNA为差异表达的RNA(P<0.05)。将差异表达的LncRNA邻近的差异表达的mRNA视为cis-靶基因,将LncRNA可能结合的蛋白质视为trans-靶蛋白,并对mRNA、cis-靶基因、trans-靶蛋白进行基因功能注释分析。从差异表达的LncRNA中选取cis-靶基因与STB发病可能相关的LncRNA用剩余各25例标本进行RT-PCR验证,筛选有诊断标志物潜力的LncRNA并进行基因功能注释分析。结果:基于两组间芯片数据的差异共筛选出444个差异表达的LncRNA、186个差异表达的mRNA。基因功能注释分析提示差异表达的LncRNA的cis-靶基因主要参与对转录、翻译、剪接、免疫反应、自然杀伤细胞介导的细胞毒性等生物学过程的调控及信号通路的传递;trans-靶蛋白主要参与对RNA的剪接、加工、转运等基因表达过程的调控;差异表达的mRNA主要参与对转录、翻译、剪接、炎症反应、免疫反应等生物学过程的调控及信号通路的传递。RT-PCR验证发现LINC01128-201、Lnc-DNALI1-205在STB患者中存在明显下调表达,与芯片检测结果一致,且这两个LncRNA可能通过调控ISG15、SNIP1、HES4表达量在STB发病过程中发挥重要作用。结论:STB患者与脊柱退变患者椎间盘的LncRNA及mRNA存在较大的表达差异,其中下调表达的LINC01128-201、Lnc-DNALI1-205可能在STB发病过程中发挥重要作用,且有成为诊断标志物的潜力。

重组幽门螺旋杆菌黏附素A的可溶性表达、纯化及其免疫学性质分析

目的 通过分子克隆、蛋白表达及纯化等技术获得重组幽门螺旋杆菌黏附素A(recombinant H.pylori adhesin A,rHpaA),免疫BALB/c小鼠,制备anti-HpaA多克隆抗体后,分析其抗体特异性。方法 利用Phyre2和DNAstar生物信息学软件分析rHpaA的三维结构及抗原性质;通过PCR长片段DNA合成技术获得黏附素HpaA基因,插入质粒pCzn1中,制备重组质粒pCzn1-rHpaA,转化E.coli Arctic Express(DE3),经IPTG诱导表达、Ni-IDA亲和层析纯化后,获得rHpaA蛋白,Western blot鉴定其反应原性。将rHpaA辅以弗氏佐剂免疫雄性BALB/c小鼠,共6只,制备antiHpaA多克隆抗体,ELISA法鉴定其抗体特异性。结果 rHpaA具有较好的三维结构及抗原性质。双酶切鉴定及基因测序证明,重组质粒pCzn1-rHpaA含有完全正确的HpaA基因序列。重组菌株pCzn1-rHpaA/Arctic Express可溶性表达目的蛋白rHpaA,约占上清总蛋白的68.3%,纯度达98.1%。rHpaA可与anti-His和anti-H.pylori抗体相结合;antiHpaA多克隆抗体可特异性识别rHpaA和H.pylori裂解物。结论 经低温诱导表达和蛋白纯化等技术,可获得高纯度目的蛋白rHpaA,制备的anti-HpaA多克隆抗体具有良好的特异性,为研究H.pylori相关诊断试剂奠定了实验基础。

幽门螺杆菌致病岛CagL重组抗原的可溶性表达及其多克隆抗体的制备和分析

目的:利用原核表达和蛋白质纯化技术获得高纯度的幽门螺杆菌致病岛CagL重组抗原(rCagL),利用其制备anti-CagL多克隆抗体,并分析抗体的特异性。方法:通过生物信息学软件分析rCagL的抗原结构;利用PCR长片段DNA合成技术合成不含有信号肽序列的幽门螺杆菌致病岛CagL基因,将其插入表达质粒p Czn1中,构建重组质粒pCzn1-rCagL。然后,将pCzn1-rCagL转入大肠杆菌Arctic Express中,经IPTG诱导表达后,通过Ni-IDA镍离子亲和层析纯化重组抗原rCagL,利用Western blot鉴定rCagL与His标签抗体和Anti-H.pylori抗体的免疫反应性;最后,通过rCagL辅以弗氏佐剂免疫BALB/c小鼠,制备anti-CagL多克隆抗血清,通过ELISA方法分析抗血清的特异性。结果:生物信息学软件表明重组抗原rCagL具有较好的抗原性质;重组质粒pCzn1-rCagL经双酶切和基因测序等技术鉴定,证实rCagL核苷酸序列与理论序列完全一致;基因工程菌株pCzn1-rCagL/Arctic Express在低温11℃条件经IPTG诱导表达。SDS-PAGE实验结果证实:rCagL可实现相对高效地可溶性蛋白表达,可溶性蛋白约占包涵体的62.07%。经Ni-IDA亲和层析柱纯化,可获得高纯度rCagL,纯度约为96.6%。Western blot结果证实:重组抗原rCagL可特异性与His标签抗体和Anti-H.pylori抗体结合。ELISA结果证实:经rCagL免疫小鼠制备的多克隆抗体anti-CagL可特异性识别rCagL和H.pylori裂解物,具有较高的抗体特异性。结论:重组抗原rCagL在低温条件下可实现可溶性表达,经纯化可获得高纯度抗原蛋白;rCagL具有较好的抗原性,制备的多克隆抗体具有较好的免疫特异性,为发展H.pylori相关诊断试剂奠定了实验基础。

幽门螺旋杆菌脂蛋白Lpp20重组抗原的可溶性表达及其免疫学性质分析

[目的]利用原核表达系统表达幽门螺旋杆菌脂蛋白Lpp20(rLpp20),分离纯化获得重组融合蛋白rLpp20,利用其制备抗rLpp20多克隆抗体,并分析其抗体的特异性。[方法]利用生物信息学软件分析rLpp20的抗原结构;通过拼接引物PCR法,获得幽门螺旋杆菌Lpp20基因序列,将其插入到质粒pCzn1中,构建重组质粒pCzn1-rLpp20,转入大肠杆菌Arctic Express中;经IPTG诱导表达rLpp20后,超声波裂菌,用Ni-IDA柱亲和纯化获得目的蛋白rLpp20。然后,利用Western Blot鉴定rLpp20与anti-H.pylori和anti-His tag的免疫反应性;最后,脂蛋白重组抗原rLpp20与弗氏佐剂混合,免疫BALB/c小鼠,制备anti-Lpp20多克隆抗血清,利用ELISA鉴定anti-Lpp20的抗体特异性。[结果]利用生物信息学软件证实rLpp20具有较好的抗原性;重组质粒pCZN1-rLpp20经双酶切和基因测序鉴定,证实rLpp20序列与理论值一致;基因工程菌株pCzn1-rLpp20/Arctic Express可以以可溶形式表达rLpp20,经Ni-IDA亲和层析柱纯化,纯度约达98.2%。Western Blot结果证实:重组抗原rLpp20可特异性与anti-H.pylori和anti-His tag结合。ELISA结果证实:所制备的anti-Lpp20抗血清具有良好的抗体特异性,可特异性识别rLpp20和H.pylori裂解物。[结论]利用E.coli Arctic Express实现了脂蛋白重组抗原rLpp20的可溶性表达,经Ni-IDA柱亲和纯化获得了高纯度rLpp20;脂蛋白重组抗原rLpp20具有良好的免疫反应性和特异性,为进一步研制幽门螺旋杆菌疫苗及相关诊断试剂盒奠定了良好的实验基础。