PKCα/β通过调控紧密连接蛋白参与百草枯致脑微血管内皮细胞的通透性异常

目的 探讨经典型蛋白激酶C(cPKC:PKC α、PKC β)是否通过调控紧密连接蛋白(tight Junction,TJ)的表达,引起百草枯(paraquat,PQ)致小鼠脑微血管内皮细胞通透性的异常。 方法 体外培养小鼠脑组织来源的血管内皮细胞株(bEnd.3)作为单层血脑屏障模型,通过Millicell-ERS细胞电阻仪测定跨内皮细胞电阻(TEER)、荧光素钠(Na-FLU)通透性测定以评价体外血脑屏障模型的功能。四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞相对存活率:终浓度0、50、100、200、300 μmol/L PQ处理细胞24 h,确定剂量-效应关系;终浓度200 μmol/L PQ分别处理细胞6、12、24、48、72 h,确定时间-效应关系。终浓度0、100、200、300 μmol/L PQ处理细胞24 h,免疫荧光(IF)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分别测定紧密连接蛋白(ZO-1、Occludin、Claudin-5)和基因的表达水平,免疫印迹法(Western blot)测定PKC α、PKC β、p-PKC α、p-PKC β蛋白表达水平;经典PKC抑制剂(Go 6983)1 μmol/L预处理细胞1 h后,200 μmol/L PQ染毒细胞24 h,Western blot法测定ZO-1、Occludin、Claudin-5及p-PKC α、p-PKC β蛋白表达水平。 结果 bEnd. 3细胞的TEER随培养时间延长逐渐升高,于第6 d达到峰值[(114.3±6.9)Ω· cm^2],荧光素钠通透性检测显示,细胞通透性随培养时间延长逐渐降低,于第6天降至(1.7±0.2)cm/min,说明细胞屏障功能良好。与对照组比较,100、200、300 μmol/L PQ染毒组细胞存活率明显降低,200 μmol/L PQ染毒细胞12、24、48、72 h,细胞存活率明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),呈剂量依赖和时间依赖关系。IF和qRT-PCR显示,随着PQ浓度的升高,ZO-1、Occludin、Claudin-5蛋白和基因表达量明显减少,差异均有统计学意义(P<0.05)。Western blot法检测显示,与对照组比较,PQ染毒组的p-PKC α、p-PKC β蛋白表达水平明显升高,ZO-1、Occludin、Claudin-5蛋白表达量明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05);Go 6983干预组的ZO-1、Occludin、Claudin-5蛋白表达水平较染毒组明显升高,p-PKC α、p-PKC β蛋白表达水平明显下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。 结论 PQ通过激活cPKC(PKC α、PKC β)导致紧密连接蛋白/基因表达降低,引起小鼠脑微血管内皮细胞通透性升高。