C6胶质瘤细胞系中脑肿瘤干细胞的悬浮培养和鉴定

目的观察C6胶质瘤细胞系中脑肿瘤干细胞的悬浮培养、增殖、分化的生物学特征。方法进行C6BTSCs的悬浮培养,应用倒置相差显微镜观察干细胞的生长特性;免疫荧光染色观察Brd U、CD133和Nestin的表达情况。结果在无血清条件培养基中,悬浮培养的C6 BTSCs增殖速度快,具有较强的增殖分裂能力,呈BrdU、CD133和Nestin强阳性,其中Brd U阳性细胞数占CD133阳性细胞数的65%以上;在含血清培养基中,BTSCs呈神经样细胞分化,其细胞形态与贴壁培养的C6胶质瘤细胞在形态上无差别。结论 C6胶质瘤细胞系中存在脑肿瘤干细胞,且该细胞可悬浮培养、增殖和分化。

NR1基因RNA干扰的海马神经干细胞体系的构建

目的:构建NR1基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)的海马神经干细胞体系,用于离体水平研究NR1对精神分裂症模型海马神经发生的调控作用。方法:利用293T细胞,将病毒原液稀释至不同病毒梯度,经过逐孔稀释法检测慢病毒滴度;体外培养海马神经干细胞,分别加入MOI值为100、10、1的慢病毒,确定海马神经干细胞的最适MOI值;海马神经干细胞体系中加入浓度为200μmol/L的MK-801 24 h后,加入干扰NR1亚基的慢病毒12 h,通过荧光显微镜观察海马神经干细胞干扰效率,通过Western Blot检测转染后海马神经干细胞NR1的蛋白表达。结果:(1)重组的慢病毒滴度可达2×10~8~2×10~9TU/m L。MOI值为100时,海马神经干细胞转染率可达90%;(2)Western Blot结果显示:感染慢病毒的海马神经干细胞中NR1蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。结论:成功构建了NR1基因RNA干扰的海马神经干细胞体系,慢病毒介导的shRNA可有效的干扰海马神经干细胞中NR1亚基的表达,为进一步探讨NR1对精神分裂症海马神经发生调控机制的研究提供了依据。

癫痫发作后成鼠及幼鼠海马神经发生的改变

目的:观察幼鼠及成鼠癫痫发作后海马神经发生的变化。方法:选用3周龄和成年雄性SD大鼠,氯化锂-匹罗卡品药物点燃造模,造模成功后根据溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)注射时间点分为24 h组、2周组,并设相应的对照组。通过免疫荧光染色技术在激光共聚焦显微镜下观察幼鼠及成年鼠海马齿状回颗粒细胞层神经细胞的增殖情况。结果:(1)幼鼠24 h及2周实验组海马齿状回颗粒细胞层BrdU阳性细胞数均显著高于相应对照组(P<0.05),且24 h组较2周组显著增多(P<0.05);(2)成年鼠24 h实验组的BrdU阳性细胞数明显多于相应对照组(P<0.05),而2周组则相反(P<0.05)。结论:癫痫发作可导致海马神经发生的改变,幼鼠癫痫发作后海马齿状回颗粒细胞层神经细胞增殖显著升高,但随着时间延长呈下降趋势。慢性癫痫发作可引起成年鼠海马神经细胞增殖的降低。

体外培养中脑神经干细胞的生物学特性鉴定及分化后TH、DJ-1和Nurr1的表达

目的：应用体外细胞培养技术，探讨腹侧中脑神经干细胞的生物学特性及分化后TH、DJ-1和Nurr1的表达情况。方法：体外分离培养新生0～1dC57BL／6仔鼠腹侧中脑神经干细胞，应用倒置相差显微镜观察中脑神经干细胞的生长状况；通过BrdU掺入实验明确神经干细胞的增殖情况；利用免疫荧光细胞染色法观察子代细胞分化趋势和DA分化相关因子TH、DJ-1和Nurr1的阳性表达情况。结果：在条件培养基的作用下，腹侧中脑神经干细胞呈悬浮的神经球生长，增殖速度较慢，干细胞数量较少；低血清自然分化条件下，中脑神经干细胞更易分化为Tuj-1阳性神经元，且分化为TH阳性神经元的数量增加；DJ-1和Nurr1呈上升趋势，且具有时间依赖性，d7与d3组比较，有显著差异（P〈0．05）。结论：结果表明腹侧中脑神经干细胞在增殖和分化方面存在区域特异性，提示腹侧中脑神经干细胞特殊的生物学特性。此研究可为干细胞移植治疗帕金森病的优势供体选择提供有利的探索和理论依据。

CPZ介导急性脱髓鞘小鼠海马中nestin的表达

目的:探讨双环己酮草酰二腙(cuprizone,CPZ)介导急性脱髓鞘小鼠海马中nestin的表达。方法:用掺入0.2%CPZ的普通饲料饲养C57BL/6小鼠6周,制备脱髓鞘模型,然后使用免疫荧光染色、q RT-PCR、Western Blot方法,检测小鼠脑内髓鞘脱失后海马中nestin的表达变化。结果:(1)体重称量结果显示:CPZ组体重明显低于对照组(P<0.01);(2)免疫荧光结果显示:CPZ组海马CA区和DG区颗粒细胞层中nestin阳性细胞明显低于对照组分别为:P<0.05,P<0.01;(3)Western Blot和q RT-PCR实验结果显示:CPZ组海马中nestin蛋白和m RNA含量均明显低于对照组(P<0.05)。结论:CPZ介导小鼠急性脱髓鞘后海马内nestin表达降低,提示髓鞘脱失可能会抑制nestin表达。

低剂量电离辐射对C6脑肿瘤干细胞增殖分化及凋亡的影响

目的观察低剂量电离辐射对C6 BTSCs增殖、分化及凋亡的影响。方法进行C6 BTSCs的悬浮培养,应用倒置相差显微镜观察干细胞的生长特性,通过Brd U和CD133免疫荧光染色法明确C6 BTSCs的增殖情况,流式细胞分析法观察低剂量电离辐射后C6 BTSCs的凋亡情况。结果在无血清条件培养基的作用下,悬浮培养的C6 BTSCs增殖速度快,干细胞数量较多;低剂量电离辐射后,0.3 Gy组促进C6 BTSCs增殖和分化能力,且0.3Gy组C6 BTSCs存活细胞数量较多,凋亡的细胞数量较少,与对照组或3.0 Gy组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 C6胶质瘤细胞系中存在具有干细胞特性的C6 BTSCs,且低剂量电离辐射刺激对C6 BTSCs的增殖、分化具有促进作用。

急性脱髓鞘对小鼠海马和大脑皮层中Nkx2.2的影响

目的:探讨双环己酮草酰二腙(CPZ)诱导急性脱髓鞘后小鼠认知功能的改变,以及海马和大脑皮层中Nkx2.2同源域转录因子(Nkx2.2)的表达变化,并探讨两种变化之间的关系.方法:0.2%CPZ喂养ICR小鼠6周建立急性脱髓鞘模型.通过Morris水迷宫(MWM)和悬尾实验(TST)检测CPZ介导的急性脱髓鞘后小鼠行为学的改变;Western Blot检测脱髓鞘后小鼠海马和大脑皮层中髓鞘碱性蛋白(MBP)和Nkx2.2蛋白的表达;免疫组织化学检测CPZ脱髓鞘后小鼠海马和大脑皮层中Nkx2.2的表达变化.结果:MWM和TST结果显示:与对照组小鼠相比,CPZ组小鼠MWM实验中的逃避潜伏期时间增加,穿越平台次数减少,TST的悬尾不动时间增加(P<0.05);Western Blot结果显示:CPZ组小鼠海马和大脑皮层中的MBP蛋白含量均明显低于对照组(P<0.05),Nkx2.2蛋白含量均明显高于对照组(P<0.05);免疫组织化学结果显示:CPZ组小鼠海马和大脑皮层中Nkx2.2的免疫阳性表达均高于对照组(P<0.05).结论:CPZ介导急性脱髓鞘后小鼠的认知功能下降,海马和大脑皮层中Nkx2.2的表达增加,提示Nkx2.2在脱髓鞘模型中的异常增加可能是导致小鼠认知功能下降的原因之一.

不育男性外周血T、AR、HSP 90表达及其对睾丸生精功能的影响

目的探讨不育男性外周血睾酮(T)、雄激素受体(AR)、热休克蛋白90(HSP 90)的表达及其对睾丸生精功能的影响。方法选择105例患者,其中正常精子30例,严重少精子症30例,无精子症45例,抽取外周静脉血,采用化学发光法测量促卵泡激素(FSH)、促黄体生成素(LH)、T浓度;采用ELISA法测量AR、HSP 90浓度,采用输精管分离钳钝性分离技术行睾丸活检。根据精液结果和睾丸穿刺有无精子以及FSH值分为A(正常精子)、B(严重少精子症)、C(无精子症,睾丸穿刺有精子,FSH 8 IU·L-1)、D(无精子症,睾丸穿刺无精子,FSH 8IU·L-1)、E(无精子症,睾丸穿刺无精子,FSH>8I U·L-1)5组,比较5组间FSH、LH、T、AR、HSP 90的差异性,分析T、AR、HSP 90的变化趋势。结果 FSH的E组高于A、B、C、D 4组(P<0.05);T的A组较B、C 2组高(P<0.05),B组较E组低(P<0.05);AR的A组高于B、C、D、E 4组(P<0.05),B组高于C、D、E 3组(P<0.05),C、D2组较E组低(P<0.05);HSP90的A组较B、C 2组高(P<0.05),较D、E 2组低(P<0.05),B组较A、C、D、E 4组低(P<0.05),C组较D、E 2组低(P<0.05),D组较E组低(P<0.05)。T的A组最高,B组最低,B、C、D、E 4组渐次升高;AR的A、B、C 3组渐次降低,而C、D、E 3组渐次升高,A组最高,C组最低;HSP90的B、C、D、E 4组渐次升高,E组最高,B组最低。结论睾丸体积正常的无精子症患者,随着睾丸精子生成能力的下降,外周血T、AR、HSP90呈现先下降再升高的趋势,且三种指标的变化趋势基本一致。