结核分枝杆菌Ag85B、TB10.4及Ag85B-TB10.4融合基因的克隆表达及生物信息学分析

目的构建结核分枝杆菌Ag85B、TB10.4及Ag85B-TB10.4融合表达载体,并进行抗原的生物信息学分析,为候选疫苗筛选奠定基础。方法从结核分枝杆菌H37Rv菌株中分别扩增出Ag85B基因,TB10.4基因,Ag85B-TB10.4;将Ag85B克隆入pET-28a(+)表达载体中,将TB10.4和Ag85B-TB10.4分别克隆入pET-SUMO表达载体中。上述重组质粒转化入大肠埃希杆菌BL21菌中(DE3),经IPTG诱导表达,并对其进行生物信息学分析。结果 (1)成功将结核分枝杆菌Ag85B和TB10.4,Ag85B-TB10.4基因分别克隆入pET28a(+)和pET-SUMO表达载体中,经IPTG诱导蛋白表达后,对经超声裂解的菌液上清进行SDSPAGE电泳,表明获得了与预期蛋白大小一致的表达产物,重组融合蛋白pET-SUMO-Ag85B-TB10.4蛋白分子质量约为54kDa。(2)生物信息学分析显示Ag85B-TB10.4融合蛋白具有多个潜在抗原位点。结论成功构建了重组质粒pET-28a-Ag85B,pET-SUMO-TB10.4和pET-SUMO-Ag85B-TB10.4,并获得了Ag85B,TB10.4和Ag85B-TB10.4的可溶性原核表达产物;生物信息学分析在Ag85B与TB10.4蛋白加入一段蛋白linker后蛋白的亲水性增强,抗原决定簇面积增大,为后续的功能实验研究奠定了基础。

宁夏枸杞叶对酒精性脂肪肝小鼠的保护作用

目的观察宁夏枸杞叶对酒精性脂肪肝小鼠的保护作用。方法成年雄性昆明种小鼠45只,随机分为3组,每组15只。空白对照组喂饲基础饲料;脂肪肝模型组喂饲高脂饲料+15%乙醇;枸杞叶干预组喂饲高脂饲料+15%乙醇+枸杞叶(枸杞叶全汁0.2mL.10g-1灌胃1次)。喂饲6周后称体重,处死小鼠,取肝脏(冰浴下制备肝组织匀浆),测定甘油三酯(triglyceride,TG)、胆固醇(cholesterol,TC),并取肝组织进行病理切片检查。结果宁夏枸杞叶对各组小鼠体重差异无统计学意义(P>0.05)。脂肪肝模型组小鼠肝脏的TC和TG含量明显高于空白对照组(P<0.01,P<0.05);枸杞叶干预组小鼠肝脏TC的含量低于脂肪肝模型组(P<0.05)。脂肪肝模型组肝细胞结构改变较为严重,并伴有炎细胞浸润及空泡样变;枸杞叶干预组肝细胞结构改变较轻,汇管区有少量炎细胞浸润。结论宁夏枸杞叶对酒精性脂肪肝小鼠有一定的保护作用。

人类错配修复基因hMLH1和hMSH2错义突变真核表达载体的构建及表达

目的构建人类错配修复基因hMLH1和hMSH2错义突变真核表达载体并检测它们在瞬时转染细胞中的蛋白表达。方法重组pcDNA3.1-hMLH1-wt和pcDNA3.1-hMSH2-wt质粒为模板,用定点诱变的方法分别构建hMLH1基因和hMSH2基因错义突变真核表达载体,将诱变前后的重组质粒瞬时转染至HCT-116细胞(hMLH1基因缺陷型)或LoVo细胞(hMSH2基因缺陷型)中,免疫印迹法和免疫荧光法分别检测这两种基因在各自的转染细胞中的蛋白表达。结果测序证实,定点突变成功,构建出hMLH1基因错义突变pcDNA3.1-hMLH1-T117M和pcDNA3.1-hMLH1-V384D真核表达载体以及hMSH2基因错义突变pcDNA3.1-hMSH2-L390F、pcDNA3.1-hMSH2-Q419K和pcDNA3.1-hMSH2-Q629R真核表达载体。结果表明转染后,除hMLH1-T117M突变体蛋白表达缺失外,其余的野生型及突变型真核表达载体在转染细胞中均能表达相应的蛋白。结论成功构建了在人的肿瘤细胞系中能有效表达的两种hMLH1基因错义突变和三种hMSH2基因错义突变的真核表达载体,为进一步研究这些错义突变的病因学作用和功能意义奠定了实验基础。

小鼠卵巢内质网应激模型的建立及诱导凋亡的研究

目的通过观察内质网应激(ERS)诱导剂衣霉素(TM)及ERS抑制剂牛磺熊去氧胆酸钠(TUDCA)对ERS相关标识性蛋白表达水平的影响,建立小鼠卵巢ERS模型。方法取4周龄昆明白小鼠卵巢,进行半卵巢培养。实验分组:新鲜对照组,不同浓度TM诱导组(1、5、10、20、30μg·mL-1),TUDCA+TM组、不同浓度TUDCA(1、2、5、10mM)+TM组。通过免疫组织化学技术观测培养1h卵巢内内质网应激伴侣蛋白GRP78、培养3h后ERS凋亡相关蛋白CHOP的表达水平;TUNEL法检测培养3、6、12、24、36、48h后卵巢细胞凋亡情况。结果与新鲜组相比,TM诱导1h后卵巢发生内质网应激反应,TM浓度为5-10μg·mL-1时GRP78表达水平达到最高(P<0.05),之后随TM浓度增加缓慢递减;TM诱导3h后卵巢内ERS凋亡相关蛋白CHOP表达水平在TM 10μg·mL-1处达到最高(P<0.05),凋亡细胞数随着培养时间的延长增加。TUDCA抑制ERS实验显示,随着TUDCA浓度的增大,10μg·mL-1TM诱导的GRP78蛋白表达呈递减趋势,其中TUDCA 10mM组GRP78表达水平基本恢复到新鲜组水平。结论 TM可诱导小鼠卵巢ERS,5μg·mL-1为诱导ERS保护作用浓度,而10μg·mL-1以上则产生ERS途径介导的凋亡。TUDCA可抑制TM诱导的卵巢ERS。

卵巢黄体血管生成及其调控的研究进展

黄体是一个暂时性的内分泌器官,对月经周期和早期妊娠的形成和维持具有重要作用。它是在排卵后残存的卵泡壁基础上经过细胞增殖、分化和细胞外基质重塑形成。研究表明[1],黄体是人体内血管化程度最高的器官之一,在黄体生成过程中经历了极速的血管新生,其速度可与肿瘤内的血管新生相比。反刍动物体内,在黄体早期85%的增殖细胞是血管内皮细胞,在成熟黄体内血管内皮细胞占增殖细胞的50%。