TLR4/NF-κB信号通路在同型半胱氨酸致内皮细胞损伤中的作用研究

目的:Toll样受体4(Toll-like receptor-4,TLR4)/核因子-κB(Nuclear factor kappa B,NF-κB)在同型半胱氨酸(Homo-cysteine,Hcy)致动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)过程中损伤内皮细胞的作用机制。方法:体外培养原代人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),用0、50、100、200、500μmol/L Hcy和100μmol/L Hcy+30μmol/L(维生素B12+叶酸)分别与HUVECs培养72 h后,采用MTT法观察Hcy对HUVECs活性的影响;用分光光度比色法检测各组HUVECs中丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD);酶免法检测NF-κB;荧光定量PCR和Westernblot分别测TLR4 mRNA和蛋白表达。结果:Hcy可抑制HUVECs的活性,各Hcy干预组与对照组比较细胞活性均降低,其中100、200、500μmol/L Hcy组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),而其他组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);随Hcy浓度增加MDA和NF-κB含量和TLR4 mRNA和蛋白表达明显增加,而各实验组SOD活性明显降低,其中,100、200、500μmol/L Hcy组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),其他组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:TLR4/NF-κB可能是Hcy致HUVECs损伤的重要机制之一,其中MDA和SOD起了重要的作用。

苦参碱对大鼠急性心肌缺血性损伤的保护作用

目的研究苦参碱对大鼠急性心肌缺血性损伤的保护作用。方法将SD大鼠随机分为7组:正常对照组、假手术组、模型组、硝酸甘油组、苦参碱2.55、、10mg/kg剂量组。应用左冠状动脉前降支(LAD)结扎法制备大鼠急性心肌缺血模型。记录结扎前、结扎后1、5、15、306、0min大鼠心率(HR)、平均动脉血压(MAP);应用分光光度计法检测血清中肌酸激酶(CK)活性和一氧化氮(NO)含量。结果静脉注射苦参碱5、10mg/kg均可使大鼠HR、MAP明显升高(P<0.05或P<0.01),此作用在左冠状动脉前降支结扎后15min最明显。静脉注射苦参碱5、10mg/kg,可降低急性心肌缺血大鼠血清CK活性(P<0.05或P<0.01);静脉注射苦参碱2.5、5、10mg/kg,可增加急性心肌缺血大鼠血清NO含量(P<0.05或P<0.01)。结论静脉注射苦参碱对大鼠急性心肌缺血性损伤有保护作用。

1型糖尿病大鼠模型的建立及糖尿病并发症相关指标的测定

目的为了研究链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)诱导大鼠1型糖尿病模型的方法并观察糖尿病并发症指标的变化。方法采用一次性腹腔注射STZ(60mg.kg-1),监测不同时点大鼠的空腹血糖、体重、饮水量及血浆中的丙二醛(maleic dialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和一氧化氮(nitric oxide,NO)等指标。结果大鼠注射STZ60mg.kg-172h后血糖值达到成模标准,并逐渐出现糖尿病表现,观察7周,始终满足成模标准,未见转复。糖尿病组大鼠肾脏及肝脏肥大指数较对照组增加(P<0.01)。糖尿病组大鼠较对照组相比血浆中脂质过氧化产物MDA水平升高,而SOD和NO水平下降(P<0.01)。结论本实验1型糖尿病模型大鼠造模成功且模型稳定,并出现了并发症发生的部分指标变化。

同型半胱氨酸致内皮细胞、平滑肌细胞和泡沫细胞低密度脂蛋白受体DNA甲基化的比较研究

目的观察同型半胱氨酸(Hcy)对内皮细胞、平滑肌细胞以及泡沫细胞中低密度脂蛋白受体(LDLR)DNA甲基化的影响。方法原代培养内皮细胞、人脐静脉血管平滑肌细胞(VSMCs)和单核细胞源性泡沫细胞,用0、50、100、200和500μM Hcy干预后培养72 h,提取基因组DNA,巢式降落式PCR(nMS-PCR)法分别检测3种细胞中LDLR DNA甲基化修饰状态的变化,以观察Hcy对不同细胞LDLR的作用和影响。结果内皮细胞、VSMCs与不同浓度Hcy培养72 h后,LDLR基因启动子区DNA呈高甲基化改变,泡沫细胞LDLR启动子区DNA呈低甲基化改变,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01),且以50或100μM Hcy组最明显。结论 Hcy对不同细胞LDLR启动子区DNA甲基化的影响有差异性,提示可能存在更深层次的机制。

苦参碱诱导A549细胞凋亡相关机制研究

目的观察苦参碱抑制人肺腺癌细胞A549的增殖作用,并探讨其可能机制。方法采用XTT比色法观察A549细胞增殖、流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡、免疫印迹检测凋亡相关蛋白表达水平、流式细胞术检测A549细胞F-actin的分布。结果苦参碱能明显抑制A549细胞的增殖,呈现剂量和时间依赖关系,能显著诱导A549细胞凋亡、降低凋亡相关蛋白Bcl–2表达(P<0.01),还可使A549细胞F–actin的含量增加。结论苦参碱可显著抑制A549细胞的增殖并诱导其凋亡,其机制可能与下调Bcl–2蛋白表达水平有关。

氧化苦参碱对家兔激素性股骨头坏死的影响

目的观察氧化苦参碱对家兔激素性股骨头缺血坏死的保护作用。方法 50只青紫兰家兔随机分为5组:空白对照组、模型对照组(醋酸泼尼松龙)、氧化苦参碱10、20、30 mg.kg-1三个剂量组,经不同剂量氧化苦参碱预处理后给予大剂量糖皮质激素诱导发生股骨头坏死。通过股骨头的病理改变来评价氧化苦参碱对激素性股骨头坏死的保护作用。通过RT-PCR和Western blot实验检测股骨头组织中VEGF的表达来讨论其可能机制。结果中、高剂量氧化苦参碱预处理组的家兔股骨头组织中未观察到明显的缺血坏死改变,且同时伴有VEGFmRNA和蛋白表达水平的增高。结论氧化苦参碱对家兔激素性股骨头坏死病变有保护作用,可上调组织中VEGF的表达。

表没食子儿茶素没食子酸酯减轻大鼠血管平滑肌细胞钙化的实验研究

目的观察表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechingallate,EGCG）对大鼠血管平滑肌细胞钙化的影响。方法制备β-甘油磷酸盐诱导血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）钙化模型。实验分为4组：对照组、钙化组、单纯EGCG组及EGCG干预组（又分为10-7、10-6、10-5和10-4mol.L-1的EGCG 4个亚组）。Von Kossa染色观察细胞钙化情况,生化试剂盒比色法测定钙含量及碱性磷酸酶（alkalinephosphatase,ALP）活性。结果 VSMCs钙化组Von Kossa染色见平滑肌细胞内和细胞间基质有大量黑色颗粒聚集;与对照组比较,钙化组VSMCs钙含量、ALP活性均有明显增加;10-7~10-4mol.L-1EGCG干预组VSMCs钙含量、ALP活性呈剂量依赖性有显著降低。结论 EGCG具有抑制VSMCs钙化的作用。

硅胶微导管套管缩窄术建立小鼠颈总动脉血管重塑模型

目的通过硅胶微导管套管缩窄术建立一种新的小鼠颈总动脉血管重塑模型,分析血管缩窄时间与血管重塑之间的关系。方法12只C57BL/6小鼠经异氟烷麻醉后,取颈正中切口,分离左、右侧颈总动脉。左侧颈总动脉行缩窄术,将长1 cm、内径0.3 mm的硅胶微导管纵向剖开后套入颈总动脉,固定并扎紧;右侧颈总动脉仅行假手术,不放置硅胶微导管,不进行缩窄术。在术后2周和4周时分别处死6只小鼠,3只用于组织病理学观察,3只用于RNA和蛋白提取。取小鼠两侧颈总动脉制作病理切片,采用H-E染色观察颈总动脉血管的显微结构,免疫组织化学染色检测颈总动脉组织中血管平滑肌细胞增殖细胞核抗原(PCNA)的表达;取两侧颈总动脉RNA和蛋白样品,采用qRT-PCR检测血管平滑肌表型转化标志分子钙调理蛋白1(CNN1)、平滑肌肌动蛋白α2(ACTA2)的表达,蛋白质印迹法检测细胞增殖相关分子周期蛋白A2、周期蛋白D1和PCNA的表达。结果12只小鼠左侧颈总动脉套管缩窄手术均获得成功,套管扎紧后即刻可见血管管腔狭窄但血流未被阻断,术后2周和4周取材时小鼠均无明显异常表现。H-E染色结果显示,术后2周时小鼠左侧颈总动脉血管外膜组织明显增生,4周时小鼠左侧颈总动脉血管中膜和内膜明显增生。免疫组织化学染色结果显示,术后2周和4周时小鼠左侧颈总动脉出现大量PCNA表达,提示平滑肌细胞异常增殖。qRT-PCR检测结果显示,术后2周和4周时小鼠左侧颈总动脉收缩型平滑肌细胞标志分子CNN1、ACTA2的表达水平均降低。蛋白质印迹法检测结果显示,术后2周和4周时小鼠左侧颈总动脉细胞周期蛋白A2、周期蛋白D1和PCNA的表达水平均升高。结论硅胶微导管套管致小鼠颈总动脉缩窄是一种简单、高效的血管重塑模型。

DNA损伤诱导的长链非编码RNA(DINO)下调MMP2表达抑制人绒毛膜滋养层细胞侵袭与迁移

目的探讨DNA损伤诱导的长链非编码RNA(DINO)通过调控迁移相关因子基质金属蛋白酶2(MMP2)的表达对人绒毛膜滋养层细胞侵袭与迁移的影响。方法收集子痫前期(PE)患者和正常孕妇的胎盘组织(对照组)各20例,Masson染色观察胎盘组织结构改变,免疫荧光组织化学染色检测胎盘组织滋养层细胞MMP2的表达;实时荧光定量PCR检测DINO的表达;将HTR-8/SVneo人绒毛膜滋养层细胞转染DINO小干扰片段(si-DINO)后,实时荧光定量PCR验证DINO、MMP2 mRNA表达,Western blot法检测MMP2蛋白表达;Transwell^(TM)侵袭实验和细胞划痕实验检测细胞侵袭、迁移情况。结果与对照组相比,PE患者血压、蛋白尿水平明显增高;胎盘组织可见纤维素样坏死,绒毛膜绒毛减少;免疫荧光显示胎盘滋养层细胞MMP2表达减弱、DINO表达增加;转染si-DINO后,DINO表达降低,而MMP2 mRNA及蛋白表达增加,HTR-8/SVneo细胞侵袭和迁移能力显著增加。结论DINO下调MMP2表达,抑制胎盘滋养层细胞的侵袭与迁移。

重组Pax6腺病毒对神经细胞周期的影响

目的检测Pax6是否直接调控细胞周期。方法重组Pax6腺病毒转染SH-SY5Y神经细胞系使Pax6过表达,用流式细胞术检测细胞周期变化。结果SH-SY5Y神经细胞系Pax6过表达未影响细胞周期G0/G1、G2/M、S期参数,经统计后与对照组无统计学意义。结论转染重组Pax6腺病毒不影响SH-SY5Y细胞周期。