MST1过表达对棕榈酸诱导非酒精性脂肪肝细胞模型脂滴生成的影响

目的通过构建哺乳动物STE20相关激酶(mammalian sterile 20-like kinase 1,MST1)过表达慢病毒,探讨MST1对棕榈酸孵育的HepG2细胞内脂滴生成的影响。方法构建MST1过表达载体,与慢病毒包装质粒共转染HEK293T细胞,获取慢病毒颗粒并检测其滴度。利用250μM棕榈酸诱导HepG2细胞,将MST1过表达慢病毒(LV-MST1)和对照慢病毒(LV-control)分别感染细胞。Western blot检测感染细胞中MST1的表达水平;利用油红O染色观察与检测细胞中脂滴的生成情况;利用细胞甘油三酯酶法检测细胞中甘油三酯的含量。结果成功获得MST1过表达慢病毒,其滴度达1×10~6TU/μL以上。Western blot检测显示MST1过表达的HepG2细胞中MST1的表达水平明显升高,脂滴生成和甘油三酯含量比对照组明显减少(P<0.05或<0.01)。结论成功构建MST1过表达慢病毒,MST1过表达明显抑制棕榈酸诱导的非酒精性脂肪肝细胞模型的脂滴生成。

棕榈酸联合TGF-β1诱导脂肪性肝纤维化细胞模型

目的通过使用不同浓度的棕榈酸(PA)、转化生长因子-β1(TGF-β1)分别诱导人肝星状细胞(LX-2)与人肝癌细胞(HepG2)探讨制备脂肪性肝纤维化细胞模型的方法。方法选用人LX-2细胞与人HepG2细胞,分别给予100、200、400μmol·L^(-1) PA处理及2、5、10 ng·mL^(-1) TGF-β1处理,两组均处理24 h后利用MTT细胞毒性实验检测细胞存活率,通过油红O染色检测细胞脂肪变性,采用qRT-PCR与Western blot实验检测细胞α-平滑肌动蛋白(α-SMA)及Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)的mRNA及蛋白表达水平,了解细胞纤维化情况。结果MTT结果显示,不同实验组与对照组比较,PA分别诱导HepG2细胞与LX-2细胞24 h后,两组细胞存活率在100、200、400μmol·L^(-1) PA的诱导下出现不同程度降低(P均<0.01);TGF-β1分别诱导两组细胞24 h后,细胞存活率在5、10 ng·mL^(-1) TGF-β1诱导下出现不同程度降低(P均<0.05)。油红O染色结果显示,与对照组相比,不同浓度PA诱导24 h后,HepG2、LX-2细胞均随PA浓度的增大,脂滴形成增多,具有明显的浓度依赖性;不同浓度TGF-β1诱导24 h后,HepG2细胞内未见明显脂滴,2、5 ng·mL^(-1) TGF-β1诱导后LX-2细胞内可见少量脂滴,10 ng·mL^(-1) TGF-β1诱导后可见LX-2细胞内脂滴明显增多。qRT-PCR结果显示,200、400μmol·L^(-1) PA诱导HepG2细胞内、400μmol·L^(-1) PA诱导LX-2细胞内α-SMA、CollagenⅠmRNA相对表达水平均上调(P均<0.01);10 ng·mL^(-1) TGF-β1诱导HepG2组细胞内CollagenⅠmRNA相对表达水平上调,5、10 ng·mL^(-1) TGF-β1诱导LX-2细胞内α-SMA、CollagenⅠmRNA相对表达水平均上调(P均<0.05)。Western blot结果显示,200、400μmol·L^(-1) PA及5、10 ng·mL^(-1) TGF-β1诱导后两组细胞内α-SMA及CollagenⅠ的蛋白相对表达水平均升高(P均<0.05)。结论200μmol·L^(-1) PA诱导HepG2细胞24 h、10 ng·mL^(-1) TGF-β1诱导LX-2细胞与HepG2细胞24 h是成功构建脂肪性肝纤维化细胞模型的适宜条件。

Bcl-2、Bax、Insulin在高脂诱导C57BL/6J小鼠胰岛损伤中的表达

目的探讨细胞凋亡因子在高脂引起的小鼠胰岛损伤中的表达。方法雄性C57BL/6J小鼠分高脂饮食组(HFD)和低脂饮食对照组(LFD),每组6只,喂养12周时尾部取血进行葡萄糖耐量实验(GTT)及胰岛素耐量实验(ITT)检测胰岛功能。持续喂养至20周时处死取胰腺组织用于透射电镜,苏木素-伊红(haematoxylineosin,HE)染色观察胰岛形态;免疫组化(immunohistochemical,IHC)检测Bcl-2、Bax及Insulin蛋白表达水平。结果喂养12周后,小鼠GTT和ITT显示,HFD组小鼠葡萄糖负荷时的血糖水平高于LFD组(P<0.05)。注射胰岛素后,HFD组小鼠血糖下降缓慢且血糖水平仍较LFD组高(P<0.05)。HE结果显示HFD组小鼠胰岛数量和体积较LFD组减少,形态损伤严重。电镜下观察HFD组胰岛β细胞超微结构受损较LFD组严重,HFD组β细胞形态不规则,细胞核固缩,染色质边集,有大量电子密度较小的脂滴堆积,其中胰岛细胞胞浆内胰岛素分泌颗粒减少。免疫组化的结果显示:HFD组Bcl-2表达低于低脂组,同时HFD组Bax表达高于LFD组,而HFD组胰岛中的Insulin表达低于LFD组(P<0.01)。结论高脂导致C57BL/6J小鼠胰岛细胞结构功能损伤,影响胰岛素的合成与分泌,并且增加细胞凋亡。Bcl-2及Bax在胰岛细胞凋亡中起一定的作用,并可能与高脂饮食有关。

非酒精性脂肪肝病靶分子Mst1相关调节miRNA的筛选及鉴定

目的探讨非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFDL)中Mst1的调控机制。方法利用TargetScan、miRDB等数据库从脂肪源性miRNAs中筛选出可能靶向鼠源Mst1 3’UTR区的miRNAs;通过Western blot初步验证miRNA对Mst1的负性调控效应;采用双荧光素酶报告基因技术确认miRNAs与Mst1的靶向关系;棕榈酸(PA)诱导AML-12小鼠肝脏细胞株成功构建NAFLD细胞模型,证实NAFLD模型中miRNAs通过调控Mst1影响NAFLD脂代谢进程。结果 Western blot实验显示miR-199a-5p、miR-342-3p和miR-691干预后Mst1的蛋白表达水平下调,Luciferases实验证明miR-199a-5p、miR-342-3p和miR-691存在直接靶向Mst1的效应,在NAFLD细胞模型中进一步证实miR-199a-5p、miR-342-3p和miR-691影响肝脏脂代谢进程。由此获得有潜在价值的负性调控miRNAs:miR-199a-5p、miR-342-3p和miR-691。结论 miR-199a-5p、miR-342-3p和miR-691能够靶向并负性调控小鼠肝脏Mst1并参与NAFLD脂代谢进程。

人肝脏MST1相关miRNA的筛选、质粒构建与验证

目的构建与人肝脏丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶4(MST1)表达相关的人源性miRNAs(hsa-miRNAs)的重组质粒并进行初步验证,为深入探讨其在肝脏脂代谢途径中的可能作用奠定基础。方法通过TargetScan、miRDB等数据库并参照文献提供的数据库信息筛选出可能靶向人肝脏MST1的脂肪组织来源miRNAs,并通过Westernblot和双荧光素酶报告基因实验进行筛选;进而改建miRNAs过表达载体骨架,并将筛选得到的miRNAs构建过表达载体,获得miRNA的过表达重组质粒;采用棕榈酸(PA)孵育人肝癌细胞株HepG2构建非酒精性脂肪肝(NAFLD)细胞模型,并验证miRNAs对NAFLD细胞模型内MST1表达的调控效应。结果成功筛选出了靶向人肝脏MST1的miRNA:hsa-miR-448和hsa-miR-518a-3p,并构建了miRNAs过表达载体,在NAFLD细胞模型中验证了hsa-miR-448和hsa-miR-518a-3p过表达对脂代谢的影响。结论初步筛选并验证了调节人肝脏MST1表达的人源性miRNAs。证实hsa-miR-448和hsa-miR-518a-3p过表达通过下调MST1及相关信号通路的关键蛋白进而影响NAFLD的进程。

调节小鼠ste20样激酶1的miRNA的筛选与功能验证

目的探讨哺乳动物ste20样激酶1(mammalian sterile20-like 1,MST1)基因的miRNAs对肝脏内脂质堆积的影响。方法利用高脂诱导非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)模型小鼠与低脂对照组小鼠的肝脏及脂肪组织进行miRNAsequence分析,选取表达上调的miRNAs,通过数据库miRDB、starBase筛选出可能靶向MST1靶基因3’UTR区的miRNAs进行研究,利用Western blot及双荧光素酶报告基因实验检测miRNAs对MST1的靶向效应。并在NAFLD细胞模型内进行MST1过表达或干扰,进一步验证miRNAs对MST1的表达调控作用。结果 Western blot实验显示得到mmu miR 149-5p和mmu miR 499-5p抑制鼠MST1基因蛋白水平的表达,Luciferases实验证明mmu miR 149-5p和mmu miR 499-5p靶向MST1能够增加AML-12细胞内的脂质堆积。结论mmu miR 149-5p、mmu miR 499-5p能够调控小鼠肝脏MST1表达并影响肝脏内脂质堆积。