LncRNA 017418及细胞因子在细粒棘球蚴rP29免疫小鼠中的表达分析

目的初步探讨长链非编码RNA 017418(lncRNA 017418)和细胞因子在细粒棘球蚴重组蛋白P29(rP29)诱导小鼠产生免疫反应中的表达。方法重组融合表达菌株pET28a-P29/BL21与LB液体培养基混合孵育,加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测纯化rP29。36只雌性BALB/c小鼠随机分为对照组、佐剂组和免疫组,每组12只,免疫组将纯化的10μg rP29与等体积弗氏完全佐剂混合乳化后,腹部皮下3点注射,总剂量100μl/鼠,佐剂组注射等体积弗氏完全佐剂,对照组不作处理;首次免疫后2周,相同剂量加强免疫1次,加强免疫采用弗氏不完全佐剂。加强免疫后2周,无菌环境下制备脾细胞悬液,分离淋巴细胞;流式细胞术分选淋巴细胞亚群CD4^+T、CD8^+T和B淋巴细胞;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测lncRNA 017418、Notch1、白细胞介素-2(IL-2)、γ干扰素(IFN-γ)、IL-10在淋巴细胞中的表达量;采用SPSS 17.0统计学软件和GraphPad Prism6.0软件对实验结果进行分析。结果经IPTG诱导表达、亲和层析法纯化,rP29蛋白相对分子质量(Mr)约为31000。qRT-PCR检测lncRNA 017418在脾淋巴细胞中的相对表达量,免疫组为2.25±0.10,高于对照组(0.81±0.05)和佐剂组(0.99±0.13)(P<0.01)。流式细胞术分析的CD4^+T、CD8^+T和B淋巴细胞所占比例分别为:对照组22.0%、9.2%和59.8%,佐剂组22.8%、7.6%和60.7%,免疫组22.1%、9.7%和60.4%。LncRNA 017418在免疫组CD4^+T淋巴细胞中的相对表达量为1.49±0.03,高于对照组(0.97±0.02)和佐剂组(1.06±0.10)(P<0.01),LncRNA 017418在免疫组CD8^+T细胞中的相对表达量为1.87±0.12,与对照组(2.06±0.14)和佐剂组(2.00±0.09)相比,差异无统计学意义(P>0.05),LncRNA 017418在免疫组B淋巴细胞中的相对表达量为1.03±0.03,与对照组(0.97±0.07)和佐剂组(1.08±0.12)相比,差异无统计学意义(P>0.05)。Notch1在免疫组CD4+T淋巴细胞中的相对表达量为1.92±0.04,高于对照组(1.10±0.10)和佐剂组(1.20±0.08)(P<0.01),IL-2的相对表达量为1.45±0.07,高于对照组(1.07±0.08)和佐剂组(1.09±0.11)(P<0.05);IFN-γ的相对表达量为1.51±0.11,高于对照组(0.92±0.05)和佐剂组(1.03±0.14)(P<0.01、0.05);IL-10的相对表达量为0.52±0.01,低于对照组(0.95±0.04)和佐剂组(1.05±0.10)(P<0.01);对照组和佐剂组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。Pearson相关系数分析lncRNA 017418与Notch1、IL-2、IFN-γ之间存在正相关关系(r=0.8244、0.5902、0.8415,均P<0.01),与IL-10之间存在负相关关系(r=-0.4432,P<0.05)。结论LncRNA 017418在细粒棘球蚴rP29诱导的小鼠中表达上调,Notch1、IL-2、IFN-γ在CD4+T淋巴细胞中表达上调,IL-10在CD4+T淋巴细胞中表达下调。

细粒棘球绦虫原头节抗原分子Eg-01883的克隆、表达及免疫原性分析

目的筛选细粒棘球蚴原头节抗原分子Eg-01883,并进行克隆、表达及免疫原性分析,为寻找棘球蚴病特异性诊断抗原提供依据。方法分析已发表的细粒棘球绦虫mRNA测序数据,筛选六钩蚴中不表达、原头节中高表达的抗原分子Eg-01883。提取细粒棘球蚴原头节总RNA,用RT-PCR对目的基因Eg-01883进行克隆,重组构建原核表达载体p ET28a-Eg-01883,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并纯化目的重组蛋白r Eg-01883。ICR小鼠随机分为3组(每组12只),免疫组小鼠的背部皮下多点注射r Eg-01883,2周后加强免疫1次(剂量均为10μg,100μl/只);佐剂组注射福氏佐剂和PBS,空白对照组不作任何处理。分别于免疫前,首次免疫后1、2、4周每组小鼠尾静脉采血,免疫后6周进行去眼球采血。用ELISA检测3组小鼠免疫后不同时间点的血清特异性Ig G抗体水平,及细胞因子白介素4(IL-4)和γ干扰素(IFN-γ)水平。蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白r Eg-01883的免疫原性。结果筛选出在细粒棘球蚴原头节中高表达的抗原分子Eg-01883,克隆、表达和纯化后获得重组蛋白r Eg-01883,该蛋白主要以包涵体形式存在。ELISA检测结果显示,用纯化后的重组蛋白r Eg-01883免疫小鼠,可诱导产生特异性Ig G抗体,免疫组小鼠的血清Ig G抗体水平自首次免疫后1周开始上升,6周时达到最高水平(2.344±0.153),显著高于佐剂组(0.206 1±0.006)和空白对照组(0.241±0.01)(P<0.01)。首次免疫后6周,血清中的细胞因子IFN-γ和IL-4水平,免疫组分别为43.23 pg/ml和24.88 pg/ml,均显著高于佐剂组(21.77 pg/ml,13.27 pg/ml)和空白对照组(17.40 pg/ml,12.25 pg/ml)(P<0.05)。Western blotting分析结果显示,该重组蛋白r Eg-01883抗原可被His-Tag标签抗体、免疫组小鼠血清、原头节继发感染的小鼠血清识别。结论筛选获得细粒棘球绦虫原头节中高表达的抗原分子Eg-01883,克隆、表达、纯化后的重组蛋白r Eg-01883免疫ICR小鼠具有较好的免疫原性。

细粒棘球绦虫原头节抗原分子Eg-08002的克隆、表达及免疫反应性分析

目的筛选细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)原头节抗原分子,并进行克隆、表达及免疫反应性分析。方法在对细粒棘球绦虫六钩蚴和原头节阶段表达的转录组测序数据进行差异分析的基础上,筛选出原头节阶段特异性表达的抗原分子。PCR扩增后克隆至p ET28a载体,构建原核表达载体pET28a-Eg-08002,转化至大肠埃希菌(Escherichia coli)JM109,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,抗His标签镍亲和层析柱纯化重组蛋白rEg-08002,快速免染聚丙烯酰胺电泳分析表达产物;蛋白质印迹(Western blotting)分析rEg-08002的免疫反应性。ELISA分析重组蛋白rEg-08002与细粒棘球蚴病患者血清和健康人血清的免疫反应性。结果筛选出了原头节中高表达的抗原分子Eg-08002,大小为612 bp,构建原核表达载体pET28a-Eg-08002。快速免染聚丙烯酰胺电泳和Western blotting分析结果显示重组蛋白rEg-08002在E.coli JM109中获得高效表达,在相对分子质量(Mr)约为23 000处可见重组蛋白rEg-08002条带,主要以包涵体形式存在,r Eg-08002可被感染棘球蚴的小鼠血清识别。ELISA分析结果表明,12份细粒棘球蚴病患者血清和12份健康人血清的平均吸光度(A450)值分别为1.245±0.265和0.469±0.006,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论筛选出了原头节中高表达的抗原分子Eg-08002,获得的重组蛋白rEg-08002具有较好的免疫反应性。