miR-17-5p靶向信号调节基因SIRPα调控巨噬细胞抗结核分枝杆菌的炎症反应

[目的]验证miR-17-5p对TLRs负向调控因子SIRPα的靶向性,探讨其对抗结核分枝杆菌(MTB)炎症反应的调控作用。[方法]利用生物信息学预测miR-17-5p对SIRPα的靶向性,构建SIRPα野生型和突变型报告载体,利用双荧光素酶报告法、Western Blot、激光共聚焦等技术验证miR-17-5p对SIRPα的靶向性;通过H37Ra感染THP-1巨噬细胞,用miR-17-5p mimics及其inhibitor处理细胞。利用Q-PCR检测H37Ra感染后miR-17-5p的表达;通过免疫荧光、Western Blot和ELISA等技术检测SIRPα和细胞因子TNF-α的表达情况。[结果]H37Ra感染可下调miR-17-5p表达,且随感染复数的增加,下调表达愈加显著;荧光素酶报告法、Western Blot等结果证实miR-17-5p可靶向结合SIRPα3’-UTR,下调SIRPα的表达,进而上调细胞因子TNF-α的表达。[结论]MTB可下调miR-17-5p表达,而miR-17-5p可靶向抑制SIRPα的表达,从而调控巨噬细胞抗MTB的炎症反应。

幽门螺旋杆菌重组抗原表位肽C-CagAL构建及其多克隆抗体特异性分析

[目的]制备幽门螺旋杆菌重组抗原表位肽C-CagAL,并分析其多克隆抗血清的特异性。[方法]用分子克隆技术构建重组表达质粒pETC-CagAL,将其转入大肠杆菌中表达,利用Ni-Agarose亲和层析纯化目的蛋白C-CagAL;免疫BALB/c小鼠,制备抗C-CagAL多克隆抗血清,通过ELISA方法分析抗血清的特异性。[结果]DNAstar等软件表明C-CagAL具有较好的抗原性,Linker易形成转角或β-折叠,为柔性结构;重组抗原C-CagAL经大肠杆菌表达,约56kDa,占菌体总蛋白的19.82%,经Ni-Agarose亲和层析纯化,获得纯度为97.5%的重组抗原C-CagAL;抗C-CagAL多克隆抗血清能够特异性识别CagA和CagL。[结论]获得了一种能够激发抗CagA和CagL特异性抗体的重组抗原表位肽C-CagAL,为进一步研究其预防幽门螺旋杆菌感染的免疫效果奠定了基础。

幽门螺杆菌多价表位疫苗CWAE的表达及其免疫学性质的研究

目的:利用生物信息学软件评价幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)多价表位疫苗CWAE的抗原结构,经原核表达获得高纯度CWAE蛋白,进而鉴定多价表位疫苗CWAE的免疫学性质。方法:通过生物信息学软件分析H. pylori多价表位疫苗CWAE的抗原结构;用人工合成的H. pylori多价表位肽融合基因WAE替换重组质粒pET28a-CUE中的UE基因,构建重组质粒pET28aCWAE。然后,将pET28a-CWAE转入大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,并通过Ni-NTP镍离子亲和层析纯化抗原蛋白CWAE;利用GM1-ELISA鉴定CWAE中CTB组分的黏膜免疫佐剂活性。最后,通过ELISA和小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验检测CWAE激发BALB/c小鼠产生抗H.pylori抗体体液免疫和淋巴细胞免疫应答的能力。结果:通过生物信息学软件证实H. pylori多价表位疫苗CWAE具有科学合理的结构;重组表达质粒pET28a-CWAE经PCR、双酶切和基因测序鉴定,融合基因CWAE与设计序列完全一致;重组基因工程菌株pET28a-CWAE/BL21(DE3)经IPTG诱导表达,抗原蛋白CWAE主要以包涵体形式存在,经Ni-NTP镍离子亲和层析纯化,纯度约达93. 2%;GM1-ELISA实验证实,CWAE中CTB组分依旧保持有较好的黏膜佐剂活性;ELISA结果证实CWAE能够激发BALB/c小鼠产生H. pylori特异性抗体,而小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验进一步证实CWAE能够激发针对H. pylori多种致病因子的淋巴细胞免疫反应。结论:H. pylori多价表位疫苗CWAE具有科学合理的抗原结构,经原核表达可获得高纯度抗原蛋白,能够激发BALB/c小鼠产生H. pylori特异性抗体体液免疫和淋巴细胞免疫应答。为研发防治H. pylori感染的多价表位疫苗奠定实验基础。