间充质干细胞诱导的神经干细胞对脑出血大鼠的神经保护作用

目的探讨胎盘间充质干细胞(pMSCs)诱导的神经干细胞(iNSCs)对脑出血(ICH)大鼠的神经保护作用。方法利用诱导培养基将胎盘间充质干细胞诱导生成神经干细胞;采用免疫荧光染色鉴定诱导生成的神经干细胞表达神经干细胞相关标记物的情况。SD大鼠随机分为假手术组(Sham组)、脑出血组(ICH组)、诱导的神经干细胞移植组(iNSCs组),构建大鼠纹状体内囊出血模型,24 h后,将诱导的神经干细胞原位移植入脑出血部位。移植7 d后,采用前肢放置实验、转角实验、改良型神经功能缺损评分等方法评估各组的神经功能;评估各组大脑血肿体积率;采用HE及尼氏染色观察各组大脑组织形态变化;采用免疫荧光双标染色观察各组神经元Cleaved-Caspase-3表达情况;采用Western blot检测各组大脑组织超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)蛋白表达水平。结果胎盘间充质干细胞诱导培养7 d后,有大量直径100μm左右、桑葚样或圆球体形的细胞球出现,细胞球中Nestin、GAP-43、Sox-2等神经干细胞标记物高表达。与ICH组比较,iNSCs组的神经功能障碍改善,且大脑血肿体积率降低(P均<0.05)。HE及尼氏(Nissl)染色结果显示,iNSCs组大脑血肿周围的炎细胞浸润数目较ICH组减少,同时,iNSCs组神经元数量增加(P<0.05)。免疫荧光双标染色结果显示,与ICH组比较,iNSCs组大脑血肿周围Cleaved-Caspase-3阳性神经元数目减少(P<0.05);Western blot结果显示,iNSCs组SOD蛋白水平高于ICH组(P<0.05)。结论胎盘间充质干细胞诱导的神经干细胞移植可能通过提高大脑抗氧化能力,减少脑出血大鼠神经元凋亡,进而促进脑出血大鼠的神经损伤修复。

间充质干细胞诱导的神经干细胞条件培养基对原代培养海马神经干细胞缺氧损伤的保护作用

目的探讨人胎盘间充质干细胞诱导的神经干细胞条件培养基对氧-糖剥夺后的海马神经干细胞的保护作用。方法建立将人胎盘间充质干细胞诱导成神经干细胞的方法,检测诱导后的神经干细胞的生物学特性;收集诱导的神经干细胞的条件培养基;原代培养小鼠海马神经干细胞并鉴定其神经干细胞相关分子的表达;建立原代海马神经干细胞氧-糖剥夺模型;采用EdU染色比较正常组(Normal组)、氧-糖剥夺组(OGD组)和氧-糖剥夺+条件培养基组(OGD+CM组)神经干细胞的增殖能力;采用免疫荧光染色法检测不同组凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase-3的表达;采用Western blot法检测不同组SOD蛋白的表达;采用流式细胞术检测不同组ROS水平情况。结果荧光染色结果显示,与Normal组相比,OGD组神经干细胞EdU阳性细胞数减少,Cleaved-Caspase-3阳性细胞数目增加(P均<0.05);与OGD组相比,OGD+CM组神经干细胞的EdU阳性细胞数增多,Cleaved-Caspase-3阳性细胞数目减少(P均<0.05)。Western blot结果显示,与Normal组相比,OGD组SOD蛋白表达下降(P<0.05);与OGD组相比,OGD+CM组SOD蛋白表达升高(P<0.05)。流式细胞术结果显示,与Normal组相比,OGD组ROS表达升高(P<0.05);与OGD组相比,OGD+CM组ROS表达降低(P<0.05)。结论人胎盘间充质干细胞诱导的神经干细胞条件培养基能够提高氧-糖剥夺损伤的海马神经干细胞的增殖能力,减少细胞凋亡并促进细胞内的抗氧化能力恢复。

枸杞籽油对亚急性衰老大鼠睾丸Nrf2/ARE通路和氧化损伤的影响

目的探索枸杞籽油对亚急性衰老大鼠睾丸Nrf2/ARE通路和氧化损伤的影响。方法将60只8周龄♂SD大鼠中的50只(空白组10只)颈部皮下注射D-半乳糖125 mg·kg^(-1),持续8周建立亚急性衰老大鼠模型,β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-gal)观察衰老细胞,HE观察睾丸形态,ELISA检测血清中睾酮(testosterone,T)、促卵泡激素(follicle stimulating hormone,FSH)和黄体生成素(luteinizing hormone,LH)及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)的水平,免疫组化和Western blot检测衰老、氧化损伤和Nrf2/ARE通路相关因子表达。结果模型鉴定成功后,经枸杞籽油干预,改善了睾丸形态,下调β-gal和γH2AX表达;升高血清中SOD、GSH以及T、FSH水平及降低MDA和LH水平(P<0.05);上调睾丸组织Nrf2、GCLC、NQO1和SOD2蛋白表达水平(P<0.05)以及支持细胞中Nrf2核表达。结论枸杞籽油激活亚急性衰老大鼠睾丸Nrf2/ARE信号通路表达,降低其氧化损伤,改善其激素水平。

针刺联合脐带间充质干细胞改善卵巢早衰大鼠卵巢储备功能研究

目的观察针刺联合脐带间充质干细胞对卵巢早衰大鼠卵巢储备功能的影响。方法70只雌性SD大鼠随意分为造模组和正常组。造模组大鼠给予去氧乙烯基环己烯(80 mg/kg)腹腔注射,制备卵巢早衰大鼠模型。造模成功后,再将其随意分为模型组、针刺组、干细胞组、联合治疗组,每组12只,剩余12只正常大鼠为空白组。针刺组针刺“关元”“气海”“足三里”;干细胞组在干预的第1、8天,经大鼠尾静脉注入人类脐带间充质干细胞液0.5 mL(细胞数为2.5×106个);联合治疗组进行针刺和尾静脉注入人类脐带间充质干细胞液。干预后,检测大鼠卵巢湿重和卵巢指数;酶联免疫吸附测定检测血清睾酮(T)、雌二醇(E2)、促卵泡激素(FSH)、黄体生成素(LH)和抗米勒管激素(AMH)水平及抗氧化指标丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)水平;HE染色检测各组大鼠卵巢形态结构变化;免疫组织化学法及蛋白质印迹法检测卵巢组织中蛋白激酶B(Akt)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)的蛋白表达水平。结果与空白组比较,模型组大鼠卵巢湿重、卵巢指数降低(P<0.01);血清LH、T、FSH、MDA水平上升(P<0.05,P<0.01),E2、AMH、GSH、SOD水平下降(P<0.05,P<0.01);HE染色显示卵巢内成熟卵泡减少,闭锁卵泡增多;卵巢组织中Akt、p-Akt、Bcl-2相对表达量下降(P<0.05,P<0.01),Bax相对表达量上升(P<0.01)。与模型组比较,针刺组、干细胞组、联合治疗组大鼠卵巢湿重、卵巢指数上升(P<0.05,P<0.01);血清中的T、FSH水平下降(P<0.05,P<0.01);血清中E2、AMH、GSH、SOD水平上升(P<0.05,P<0.01);HE染色显示卵巢异常情况减少;卵巢组织中p-Akt、Bcl-2阳性表达与蛋白相对表达量上升(P<0.05,P<0.01),Bax阳性表达与蛋白相对表达量下降(P<0.05,P<0.01)。与针刺组和干细胞组比较,联合治疗组卵巢湿重上升(P<0.05),血清T、FSH水平下降(P<0.05,P<0.01),AMH水平上升(P<0.05,P<0.01),Akt阳性表达上升(P<0.05)。与针刺组比较,联合治疗组SOD、GSH水平上升(P<0.01),Bax蛋白相对表达量下降(P<0.01)。与干细胞组比较,联合治疗组血清MDA水平下降(P<0.05)。结论针刺、干细胞和联合治疗对卵巢早衰大鼠均能起到积极治疗作用,均能改善卵巢早衰大鼠卵巢储备功能,促进卵巢颗粒细胞增殖,抑制卵泡凋亡;且联合治疗效果优于单纯针刺和干细胞治疗。

黄芪甲苷减轻环磷酰胺诱导的早发性卵巢功能不全模型大鼠卵巢炎症反应

目的:研究黄芪甲苷(astragaloside Ⅳ,AS-IV)是否通过抑制核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信号通路降低环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)诱导的早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency,POI)模型大鼠炎症反应。方法:动情周期正常的雌性SD大鼠80只,选取12只为正常对照组,其余68只大鼠用CTX腹腔注射诱导建立POI模型。将模型制备成功的60只大鼠随机分为5组,每组12只,分别为POI模型组、芬吗通组、低剂量AS-IV组、中剂量AS-IV组和高剂量AS-IV组,干预28 d后取样。采用ELISA法测定血清中17β-雌二醇(17β-estradiol,17β-E2)、抗缪勒管激素(anti-Müllerian hormone,AMH)、促卵泡生成素(follicle-stimulating hormone,FSH)和黄体生成素(luteinizing hormone,LH)水平;转录组测序筛选差异表达基因及功能富集;HE染色法观察卵巢组织病理变化并进行卵泡计数;免疫组织化学染色法和Western blot法分别进行p65(胞核)、p-p65和p-IκBα及下游促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α及IL-8的定位表达和相对表达水平检测。结果:用CTX诱导15 d建立的POI模型大鼠动情周期紊乱;与正常对照组相比,POI模型大鼠血清17β-E2和AMH显著降低、FSH和LH显著升高(P<0.01)。经各组相应干预28 d后,与POI模型组相比,中剂量AS-IV组大鼠血清17β-E2和AMH水平升高、FSH和LH水平降低,差异显著(P<0.01)。基于转录组测序结果发现,POI模型组与中剂量AS-IV组有274个差异表达基因,富集在炎症相关功能基因簇。HE染色显示,与正常对照组相比,POI模型组大鼠卵巢组织结构紊乱,初级卵泡和成熟卵泡数目减少,闭锁卵泡数目增多(P<0.01);与POI模型组相比,中剂量AS-IV组大鼠卵巢组织初级卵泡和成熟卵泡数目增多(P<0.01)。芬吗通治疗后初级卵泡数量较模型组没有差异,可见的有腔卵泡数量较模型组增多,但多为闭锁卵泡。与正常对照组相比,POI模型组p65(胞核)、p-p65、p-IκBα、IL-6、IL-1β、TNF-α及IL-8的蛋白表达量显著升高(P<0.05);与POI模型组相比,芬吗通组和中剂量AS-IV组p65(胞核)、p-p65/p65、p-IκBα、IL-6、IL-1β、TNF-α及IL-8的蛋白水平显著降低(P<0.05)。结论:AS-IV可能通过介导NF-κB信号通路抑制卵巢炎症反应,从而改善CTX诱导的POI模型大鼠的卵巢形态结构和功能。

健脾益肾化浊方对多囊卵巢综合征模型大鼠卵巢颗粒细胞凋亡蛋白及PI3K/AKT/mTOR通路的影响

目的 探讨健脾益肾化浊方治疗多囊卵巢综合征(PCOS)的可能作用机制。方法 70只SD雌性大鼠随机分为空白组和模型组各15只,二甲双胍组,健脾益肾化浊方低、中、高剂量组各10只。除空白组外,其余各组均采用来曲唑灌胃联合高脂饲料喂养21天构建PCOS模型。造模成功后,空白组和模型组用10 ml/(kg·d)生理盐水灌胃;二甲双胍组用盐酸二甲双胍片100 mg/(kg·d)灌胃;健脾益肾化浊方低、中、高剂量组分别用健脾益肾化浊方药物混悬液1.275、2.55、5.10 g/(kg·d)灌胃,干预30天。将卵巢称重并计算卵巢指数;ELISA法测定大鼠血清促卵泡生成素(FSH)、促黄体生成素(LH)、睾酮(T)、抗苗勒管激素(AMH)和雌二醇(E2)水平;HE染色观察卵巢组织形态改变;免疫组织化学染色法检测大鼠卵巢组织半胱氨酸天冬氨酸酶3 (Caspase-3)、半胱氨酸天冬氨酸酶9 (Caspase-9)和磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、蛋白激酶B (AKT)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋(mTOR)蛋白阳性表达;Western blot法检测大鼠卵巢组织促凋亡蛋白(BAX)、抗凋亡蛋白(Bcl-2)、Caspase-9、细胞色素C (Cytochrome-C)和PI3K、AKT、mTOR蛋白相对表达。结果 与空白组比较,模型组大鼠卵巢组织以囊性扩张卵泡为主,颗粒细胞层减少,间质增生明显;卵巢指数、血清T、LH、AMH、卵巢组织Caspase-3、Caspase-9平均光密度和BAX/Bcl-2值、Cytochrome-C、Caspase-9蛋白相对表达量明显升高,血清E2、FSH及卵巢组织PI3K、AKT、mTOR平均光密度和蛋白表达显著降低(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较,健脾益肾化浊方各剂量组和二甲双胍组卵巢组织多囊样改变得到改善,可见各级卵泡和黄体,颗粒细胞层增厚,卵巢指数、血清LH、AMH、卵巢组织Caspase-9平均光密度和蛋白相对表达明显降低,血清E2、FSH,卵巢组织PI3K和AKT平均光密度,PI3K、AKT和mTOR蛋白相对表达显著升高(P<0.05或P<0.01);二甲双胍组和健脾益肾化浊方中、高剂量组血清T水平和Caspase-3平均光密度显著下降,健脾益肾化浊方低、高剂量组和二甲双胍组mTOR平均光密度显著增加、BAX/Bcl-2值明显降低,二甲双胍组和健脾益肾化浊方高剂量组卵巢组织Cytochrome-C蛋白表达显著降低(P<0.05或P<0.01)。与二甲双胍组相比,健脾益肾化浊方低剂量组血清T水平明显升高,健脾益肾化浊方中剂量组BAX/Bcl-2值显著升高(P<0.05);与健脾益肾化浊方中剂量组相比,健脾益肾化浊方高剂量组Cytochrome-C蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论 健脾益肾化浊方可抑制PCOS大鼠卵巢颗粒细胞凋亡蛋白表达,从而维持内分泌平衡以改善卵巢生殖功能,其机制可能与激活PI3K/AKT/mTOR信号通路有关。

基于Nrf2/HO-1信号通路探讨浓缩当归丸对缓解卵巢功能不全大鼠卵巢氧化应激损伤的影响

目的:探讨浓缩当归丸改善卵巢功能不全大鼠卵巢氧化应激损伤的作用及机制。方法:36只成年雌性SD大鼠,随机分为正常组、模型组、雌二醇(E2)/地屈孕酮片组、浓缩当归丸高、中、低剂量组,每组6只。除正常组外,其余各组大鼠每日腹腔注射乙烯基环己烯(VCD)80 mg·kg^(-1)造模,连续14 d。从第15天起,模型组灌胃生理盐水2 mL·kg^(-1);雌二醇/地屈孕酮片组灌胃芬吗通0.3 mg·kg^(-1);浓缩当归丸高、中、低剂量组灌胃浓缩当归丸2.08、4.16、8.32 g·kg^(-1),每日1次,连续给药28 d。测定大鼠卵巢指数;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清中相关激素E2、促卵泡激素(FSH)、卵泡刺激素(FSH)、促黄体生成素(LH)和抗缪勒管激素(AMH)水平,以及血清过氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽(GSH)含量;硫代巴比妥酸(TAB)法检测血清丙二醛(MDA)含量;苏木素-伊红(HE)染色法观察卵巢形态学变化;免疫组化法(IHC)检测卵巢组织中核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素氧合酶^(-1)(HO^(-1))、SOD2、SOD1的表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测卵巢组织中Nrf2、HO^(-1)、SOD2、SOD1蛋白的相对表达量。结果:与正常组比较,模型组大鼠卵巢中生长卵泡明显减少、卵泡颗粒层排列松散;大鼠体质量、卵巢指数和血清AMH、E2水平显著下降,LH、FSH水平均显著升高(P<0.01);SOD和GSH水平显著下降(P<0.01),MDA水平显著升高(P<0.01)。与模型组比较,E2/地屈孕酮片组和浓缩当归丸各组卵巢指数均明显增加(P<0.05,P<0.01),血清中E2水平明显升高(P<0.05,P<0.01),FSH、AMH、LH水平明显降低(P<0.05,P<0.01);卵巢内生长卵泡数量增多;血清中SOD活性增强,GSH含量升高,MDA含量明显下降(P<0.05,P<0.01);卵巢组织中Nrf2、HO^(-1)、SOD2、SOD1蛋白表达水平明显上调(P<0.05,P<0.01)。结论:浓缩当归丸能够调节血清激素水平,且增加卵巢组织中Nrf2、HO^(-1)、SOD2、SOD1因子的表达,提高卵巢组织抗氧化能力抵抗氧化应激损伤,从而改善卵巢储备功能。

二甲双胍调节自噬保护亚急性衰老大鼠睾丸功能的作用

目的:研究二甲双胍(Met)对D-半乳糖构建的亚急性衰老模型大鼠睾丸功能的影响及其分子调控机制。方法:颈部皮下注射D-半乳糖制备亚急性衰老大鼠模型。次月予以Met溶液灌胃治疗,每周监测大鼠的体重,测定大鼠睾丸重量、睾丸指数;ELISA法检测大鼠血清睾酮(testosterone,T)、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)和雌二醇(E)水平;HE染色法观察睾丸形态;免疫组化染色检测衰老相关蛋白[β-半乳糖苷酶(β-gal)、p16和p21]、睾丸自噬相关蛋白[磷酸酶张力蛋白同源物诱导激酶1(PINK1)、Parkin、自噬效应蛋白(Beclin-1)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)和p62]和睾酮合成关键酶[类固醇激素合成急性调节蛋白(StAR)、细胞色素侧链裂解酶(CYP11A1)和17-β-羟基类固醇脱氢酶3(HSD17β3)]的表达情况,并用Western blot检测上述蛋白的表达量。结果:与对照组相比,衰老模型组和Met组大鼠体重整体呈下降趋势;衰老模型组睾丸重量及指数下降(P<0.01),Met干预后显著上升(P<0.001)。衰老模型组中T,FSH和E水平均显著下降(P<0.05),LH水平明显升高(P<0.01)。模型组衰老相关蛋白β-gal,p16和p21在睾丸细胞质中有明显阳性表达;与衰老模型组相比,Met干预后睾酮合成关键酶StAR,CYP11A1和HSD17β3的表达水平均显著性上升(P<0.05),自噬相关蛋白PINK1,Parkin,Beclin-1和LC3蛋白表达显著升高(P<0.05),p62蛋白表达显著下降(P<0.05)。结论:二甲双胍能激活睾丸自噬水平,增加睾酮合成关键酶的水平,从而预防亚急性衰老大鼠睾丸功能减退。

月见草油抵抗多囊卵巢综合征大鼠卵巢氧化应激

目的探讨月见草油(EPO)对高脂饮食联合来曲唑所致多囊卵巢综合征(PCOS)模型大鼠激素水平、代谢水平、氧化水平以及卵巢组织中NAD-依赖性去乙酰化酶Sirtuin-1(SIRT1)/转录因子叉头框蛋白O1(FoxO1)信号通路表达的影响。方法72只大鼠共分为6组,12只为正常对照,其余60只大鼠喂食高脂饲料(40%脂肪)8周,并在喂食方案的最后3周,联合浓度为1 mg/(kg·d)的来曲唑灌胃21 d,制备PCOS大鼠模型。模型制备结束后经尾部血清激素水平分析,每组剔除偏差较大的模型大鼠2只,并把正常对照组和模型制备成功的大鼠分为6组,每组10只,分别为正常对照组、PCOS模型组、二甲双胍组、EPO小剂量组、EPO中剂量组、EPO大剂量组。ELISA方法和生化酶法检测各组血清空腹血糖(FPG)、空腹胰岛素(FINS)、睾酮(T)、促卵泡生成激素(FSH)、促黄体生成激素(LH)、超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA),苏木精-伊红(HE)染色观察各组卵巢形态,免疫组织化学和蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测卵巢组织SIRT1/FoxO1通路和相关抗氧化因子SOD1和谷胱甘肽转移酶(GST)以及衰老因子SIRT1和FoxO1的定位与相对表达水平。结果与正常对照组相比,PCOS模型组体质量、FPG、FINS、T、LH和FSH水平均升高(P<0.001);SOD和T-AOC水平下降(P<0.001),MDA水平升高(P<0.001)。ELISA结果显示,EPO和二甲双胍治疗后,体质量、FPG、FINS水平较PCOS模型组均呈下降趋势且有统计学意义(P<0.001),各组SOD水平与PCOS模型组相比升高(P<0.001),MDA水平下降(P<0.05),二甲双胍组、EPO中剂量组和大剂量组T-AOC水平较PCOS模型组升高(P<0.001);二甲双胍组和EPO中剂量组、大剂量组T和LH水平较PCOS模型组下降(P<0.001);二甲双胍组和EPO治疗大剂量组FSH水平较PCOS模型组下降(P<0.001)。免疫组化结果显示,SOD1、GST和SIRT1蛋白在颗粒细胞、间质细胞、原始卵泡和黄体均有阳性表达;Western blotting结果显示,与正常对照组相比,PCOS模型组卵巢组织SIRT1(P<0.001)、FoxO1、P-FoxO1、P-FoxO1/FoxO1(P=0.003)、SOD1(P=0.003)和GST蛋白表达量均增加(P<0.001);EPO大剂量组SOD1(P=0.003)、GST(P=0.007)和P-FoxO1蛋白表达较PCOS模型组下降(P=0.003),EPO中剂量组SIRT1(P=0.011)和FoxO1(P=0.353)蛋白表达下降。结论EPO改善PCOS模型大鼠血清中氧化因子和激素水平,且抑制SIRT1/FoxO1信号通路因子表达,提高卵巢组织的抗氧化能力并改善其氧化应激。