2015-2021年宁夏某三甲医院耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的临床分布及耐药性变迁

目的了解某医院7年间肺炎克雷伯菌(KP)及耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)的临床分布和抗菌药物耐药性的变化和趋势,为临床医生和决策部门对抗菌药物的合理使用提供支持。方法收集2015-2021年某医院临床分离的KP及CRKP菌株,采用WHONET 5.6和SPSS 26.0软件对标本来源、科室来源、药敏试验结果及常用抗菌药物的耐药性变迁进行回顾性分析。结果2015-2021年共分离非重复KP 8181株,急诊科检出率最高(15.69%);主要分离自痰液(51.83%)。KP对头孢唑林、亚胺培南和阿米卡星的平均耐药率分别为64.36%、3.97%和3.31%。2015-2018年肺炎克雷伯菌对常见抗菌药物的耐药性有明显上升,从2018年开始,近两年肺炎克雷伯菌对常见抗菌药物及亚胺培南、美罗培南等碳青霉烯类抗菌药物的耐药性出现下降。2015-2021年共分离CRKP 327株,检出率呈上升趋势,近两年检出率有所下降。CRKP对头孢菌素类等临床常用抗菌药物均表现为高度耐药,对庆大霉素、左氧氟沙星等抗菌药物耐药性出现下降,对多黏菌素B、替加环素敏感。结论2015-2021年间该医院临床分离KP和CRKP菌株对多数抗菌药物的耐药率总体呈先上升后下降的趋势。耐药率总体趋势呈上升趋势,定期进行细菌耐药性监测有助于了解细菌耐药性变化,预防和控制CRKP的产生和传播。

改良微量肉汤药敏实验应用效果分析

目的探讨改良微量肉汤药敏实验(荧光法)应用效果及可靠性。方法通过改良微量肉汤药敏实验(荧光法)、VITEK2全自动细菌鉴定仪、微量肉汤稀释法分别对标准菌株金黄色葡萄球菌ATCC29213和大肠埃希菌ATCC25922进行三种不同抗生素(金黄色葡萄球菌ATCC29213:苯唑西林、利奈唑胺和环丙沙星;大肠埃希菌ATCC25922:庆大霉素、环丙沙星和亚胺培南)的药敏实验,并对5株临床分离金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌分别进行4种不同抗生素(金黄色葡萄球菌:苯唑西林、利奈唑胺、青霉素和红霉素;大肠埃希菌:亚胺培南、头孢曲松、哌拉西林和妥布霉素)的药敏实验,检测最低抑菌浓度(MIC)并记录检测周转时间(turn-around time,TAT),比较三种方法检测结果的一致性。结果改良微量肉汤药敏实验(荧光法)与VITEK2全自动细菌鉴定仪、微量肉汤稀释法检测标准菌株和临床分离菌株的MIC基本一致(Cohen’skappa值为1.000,P=0.083),即三种抗生素敏感性实验结果具有高度吻合性;改良微量肉汤药敏实验(荧光法)对金黄色葡萄球菌的TAT(约10 h)均低于VITEK2全自动细菌鉴定仪(约17 h)和微量肉汤稀释法(约22 h)(P均<0.05)。结论改良微量肉汤药敏实验(荧光法)较VITEK2全自动细菌鉴定仪更快捷,较微量肉汤稀释法更省时,并可通过进一步优化为今后的临床检验工作提供全新的快速药敏检测方法。

基于生物信息学探讨弓形虫ROP16_Ⅰ对A549细胞表达谱的影响

目的采用生物信息学对ROP16 Ⅰ基因转染的A549细胞株的表达谱芯片结果进行数据挖掘,寻找影响Ⅰ型弓形虫疾病的差异表达基因,为揭示Ⅰ型弓形虫疾病的发病机制提供依据。方法通过生物信息学方法对过表达ROP16 Ⅰ的A549细胞株的表达谱进行研究,从中筛选差异表达基因。将得到的数据导入在线分析工具ToppGene和STRING中对差异表达基因进行筛选,同时进行GO 分析及KEGG分析。结果本研究共获得了483个差异表达基因,其中上调的基因共有252个,下调的基因共有231个。ToppGene最终筛选得到CCL8、CXCL11、PIAS1及EIF2AK2等14个Ι型弓形虫相关的基因。GO分析和KEGG分析发现,这些候选基因与白介素IL-10、IL-4、IL-13信号通路,细胞因子-细胞因子受体相互作用通路及Toll样受体信号通路等相关。在蛋白-蛋白互作网络中,这14个候选基因恰好处于网络的最核心位置。结论Ι型弓形虫疾病的发生可能与CCL8、CXCL11、PIAS1及EIF2AK2等基因密切相关。

慢性阻塞性肺疾病患者肠道微生物组成及基因功能分析

目的探讨慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者肠道微生物组成、丰度及差异基因功能变化。方法收集我院呼吸科10例确诊COPD患者(COPD组)和10例对照受试者(对照组)粪便样品进行宏基因组高通量测序分析。结果PCA分析组间比较发现2组研究对象粪便样品微生物群落差异大,具有可比性。物种组成分析显示:对照组粪便样品中高度富集的菌科主要包括毛螺菌科、理研菌科、韦荣球菌科、优杆菌科、臭杆菌科、氨基酸球菌科、乳杆菌科等,属层面富集的主要包括罗斯菌属、胃瘤球菌属、小杆菌属、真杆菌属、拟杆菌属、粪球菌属、双歧杆菌属等;COPD组粪便样品富集菌群主要包括紫单胞菌科、Selenomonadaceae、巨单胞菌属和韦荣球菌属。物种多样性分析与对照组相比,COPD组多样性更低,差异有统计学意义(W=87,P=0.0039)。物种相关性网络图分析显示与其他门类菌群相比,拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门与其他物种的关联性最强(size=52.07、18.87、14.01)。组间差异基因进行GO功能显著性富集分析,差异基因均富集在如细胞学过程、刺激应答、生物学黏附及调节、代谢过程及信号通路等。KEGG功能显著性富集分析显示差异基因主要富集途径包括代谢途径、次生代谢物合成、淀粉和蔗糖的合成、抗生素的合成等。结论COPD患者肠道内存在菌群及基因功能失调。

IL-6/STAT3信号通路与肝癌研究进展

IL-6是一种多效细胞因子,主要通过IL-6/STAT3信号通路发挥生物学效应。IL-6在肿瘤微环境中含量丰富,异常激活的IL-6/STAT3信号通路可通过影响肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭、血管生成和凋亡等过程参与肝细胞癌(HCC)发生发展。靶向药物可通过阻断该信号通路显著抑制肝癌细胞恶性生物学行为,miRNAs可多靶点作用于IL-6/STAT3信号通路,抑制肝癌发生发展。深入了解IL-6/STAT3信号通路与HCC的关系有助于阐明其发病机制,并为HCC治疗提供新方向。

短链脂肪酸对THP-1细胞和COPD小鼠炎症反应的影响

目的探讨短链脂肪酸在人单核细胞白血病(THP-1)细胞和慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)中的抗炎作用及意义。方法采用qRT-PCR、ELISA、Western blotting、HE染色、天狼星染色实验方法检测短链脂肪酸处理前、后的THP-1细胞和COPD小鼠炎症因子变化。结果ELISA和qRT-PCR检测结果表明,COPD患者血清中炎症因子白介素6(interleukin-6,IL-6)、白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)mRNA表达和浓度高于健康人群;THP-1细胞系在LPS刺激后这些炎症因子高表达,经过短链脂肪酸处理后,丁酸盐比乙酸盐和丙酸盐能更好降低这些炎症因子的表达。在COPD小鼠饮水中加入丁酸盐后,通过qRT-PCR和ELISA检测发现,小鼠肺组织炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-αmRNA表达降低,外周血炎症因子IL-6和IL-1β浓度降低,但TNF-α浓度并无统计学差异;Western blotting检测蛋白结果表明,转录因子kappa B(NF-κB)磷酸化表达降低,丁酸盐可能通过抑制NF-κB信号通路而抑制炎症因子的表达。结论短链脂肪酸中的丁酸盐能够抑制由LPS诱导的THP-1细胞炎症反应,并对COPD小鼠的炎症起到一定抑制作用。

弓形虫ROP16_Ⅱ效应分子对宿主A549细胞基因表达谱的影响

目的 ROPl6在弓形虫入侵宿主细胞的过程中发挥着关键作用。为了提高ROP16对宿主细胞的分子功能的认识,本研究分析了ROP16_Ⅱ基因转染的A549细胞株的表达谱,筛选了新的候选基因,为揭示Ⅱ型弓形虫病的发病机制提供了依据。方法通过表达谱芯片技术对过表达ROP16_Ⅱ的A549细胞株的表达谱进行研究,并从中筛选差异表达基因。利用ToppGene从差异表达基因中筛选候选基因,并通过RT-qPCR对获得的基因进行验证。结果共获得了9 994个差异表达基因,其中上调的基因有4 293个,下调的基因有5 701个。将这些差异表达基因进行GO功能富集分类,主要涉及多种生物学过程,包括发育过程、生物调控、免疫应答和信号传导等过程。采用ToppGene筛选得到4个疾病候选基因,其中上调表达的有IL4R和STAT1;下调表达的有IL12RB1和IL2RG。RT-qPCR结果与表达谱芯片数据一致。结论 ROP16_Ⅱ入侵宿主细胞后影响宿主细胞基因表达谱,了解ROP16_Ⅱ的作用机制,对于更加全面地揭示Ⅱ型弓形虫病的发病机制具有重要意义。

弓形虫多态性ROP16效应分子诱导宿主A549细胞基因表达谱的差异研究

目的探讨弓形虫Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型ROP16对宿主基因表达谱的影响及其意义。方法以A549细胞株为研究模型,建立弓形虫Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型ROP16稳定转染的A549细胞株,通过表达谱芯片技术筛选差异表达基因,并对差异基因进行GO分析和Pathway通路分析。结果对差异基因进行聚类,发现ROP16I转染组776个基因表达上调,494个基因表达下调;ROP16Ⅲ转染组842个基因表达上调,520个基因表达下调;而ROP16Ⅱ转染组5 063个基因表达上调,5 989个基因表达下调。另外,ROP16Ⅰ/Ⅲ转染组基因表达谱相似。而ROP16Ⅱ转染组则不同,表达谱差异显著。对ROP16Ⅱ转染组差异基因进行Pathway通路分析发现,显著改变的通路共有74条,其中ROP16Ⅱ单独调控的信号通路有19条,主要与NF-κB、Toll样受体,趋化因子等信号通路、炎症反应及免疫调节和代谢等相关。结论 ROP16入侵宿主细胞核后影响宿主细胞基因表达谱。同Ⅰ、Ⅲ型弓形虫相比,Ⅱ型弓形虫在基因组上的差异导致其具有独特的差异基因表达谱和信号通路,了解其单独调控的信号通路对于Ⅱ型弓形虫的防治具有重要意义。

ISO15189认可关于CYP2C19基因多态性检测性能验证评价

目的评价荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测人类CYP2C19基因多态性的分析性能。方法依据ISO15189认可要求对试剂盒的准确度(与金标准比较)、特异度、精密度、检测下限和抗干扰能力进行性能评价。结果 20份临床标本荧光定量PCR与Sanger测序法结果比对,准确度符合率为100%(测序符合率为100%);10份临床标本3个基因型位点荧光定量PCR与Sanger测序法结果均为野生型,特异度符合率为100%;荧光定量PCR对临床标本重复检测15次的结果完全一致,且Ct值CV≤5%;试剂盒最低检出限为0.550ng/μL;血红蛋白、胆红素和三酰甘油3种干扰物质加入已知基因型结果的血液标本后进行检测,与对照结果符合率为100%。结论荧光定量PCR检测人类CYP2C19基因多态性的性能验证满足ISO15189认可要求,适合于临床应用。

鲍曼不动杆菌abaI基因的克隆表达分析、同源建模及分子对接分析

高丝氨酸内脂合成酶(homoserine lactone synthase,abaI)是导致鲍曼不动杆菌生物被膜形成的关键酶之一,对其结构功能的研究有助于我们对抑制生物被膜形成有很大帮助。本研究通过Genebank查找abaI(A1S_0109)蛋白序列,运用分子技术对其进行表达分析,应用生物分析软件ExPASy、ESPript、MEG5.0、SWISS-MODEL等对其进行结构分析,使用分子对接软件分析抑制剂的关键结合位点。结果显示,在含有pET28a-abaI重组质粒BL21菌株与野生BL21菌株相比生物被膜形成能力以及运动性显著增高。从生成生物膜被膜的定义上,BL21从不产生物被膜菌株,变成了产膜菌株。预测其结构蛋白与TofI蛋白高度相似,通过分子对接首次揭示abaI蛋白抑制剂与abaI蛋白相互作用关系。研究结果显示abaI在BL21中能够促使生物被膜的形成和增强细菌的运动,分子对接揭示了abaI蛋白的相互作用位点,为进一步研究其活性以及抑制剂提供了重要的参考信息。

青年与老年女性乳腺非特殊型浸润性癌临床病理特征分析

目的探讨青年与老年女性乳腺非特殊型浸润性癌患者的临床病理学特征差异的临床应用价值。方法收集2018—2019年我院212例女性乳腺非特殊型浸润性癌患者临床病理资料,根据年龄分为青年组(≤35岁)、老年组(≥60岁),回顾性分析两组患者的临床病理特征差异。结果两组患者的癌灶位置、癌灶大小、病理分级、病理分期及淋巴结转移方面差异均无统计学意义(P均>0.05)。老年组ER阳性率(76.3%)比青年组(59.0%)增高(P<0.05);青年组HER2阳性率(66.7%)及Ki67高表达率(76.9%)则高于老年组(47.4%,56.1%,P<0.05);在分子分型方面老年组以Luminal A型居多(39.9%),青年组以HER2亚型为主(41.0%)(P<0.05)。结论青年女性乳腺非特殊型浸润性癌比老年者具有更高侵袭力、增殖活性。

产气荚膜梭菌TaqMan实时荧光定量PCR特异性引物设计和方法验证

目的建立针对水样中产气荚膜梭菌检测的TaqMan实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)方法,并测试该方法在自来水样中的检测效果。方法选择位于该菌拟核中高度保守的plc基因,设计特异性引物和TaqMan探针,经优化后建立了针对该菌的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,结合滤膜法处理含有plc基因的标准菌株的模拟污染水样,并对所建立的方法进行测试。结果所建立的产气荚膜梭菌TaqMan实时荧光定量PCR检测方法具有高度的特异性,13株食源性致病菌、3株艰难梭菌及1株腐败梭菌的Ct值大于40;该方法的最低检出限为1×10 copies/μL,具有较高的灵敏性;对模拟污染水样的最低检测限为1.0×10^(2)CFU/mL。应用该方法对4份人工模拟污染阳性水样与90份自来水样进行检测发现,2份1.0×10^(2)CFU/mL的模拟污染水样可检出产气荚膜梭菌,2份1.0×10 CFU/mL的模拟污染水样与90份自来水样均未检出产气荚膜梭菌。结论所建立的产气荚膜梭菌TaqMan实时荧光定量PCR检测方法具有特异性好、灵敏性高的优点,对水体中产气荚膜梭菌的检测具有较高的应用价值。

群体密度感应分子对鲍曼不动杆菌生物被膜形成及菌毛集合系统的影响

目的探讨群体密度感应系统小分子N-3-oxo-octanoyl-L-Homoserine lactone(3-oxo-C8-AHL)对鲍曼不动杆菌ATCC17978菌株菌毛集合系统基因表达以及生物被膜形成能力的影响。方法通过细菌运动性试验及生物被膜定量试验测定3-oxo-C8-AHL对ATCC17978生物膜形成的影响;结晶紫试验观察ATCC17978生物被膜形成的结构;荧光定量PCR方法测定3-oxo-C8-AHL对ATCC17978CusABCDE、BfmS、BfmR基因相对表达量的影响。结果对照组与3-oxo-C8-AHL组ATCC17978运动直径分别为(3.0±0.1)cm和(1.0±0.1)cm,差异有统计学意义(t=34.652,F=0.313,P<0.05);生物膜形成试验测得3-oxo-C8-AHL组和对照组A值分别为0.07733和0.099,差异有统计学意义(t=-7.941,F==2,P<0.05);结晶紫染色观察3-oxo-C8-AHL组细菌不易聚集形成生物被膜,而对照组易聚集、成膜;荧光定量PCR测定了3-oxo-C8-AHL组菌毛集合系统CusABCDE基因相对表达量较对照组下降34.1%以上(P<0.05),BfmS和BfmR基因表达较对照组分别下调44.1%和38.2%(P<0.05)。结论菌毛集合系统基因与生物被膜形成密切相关,群体密度感应系统小分子3-oxo-C8-AHL对菌毛集合系统等相关基因的表达具有下调作用,从而抑制鲍曼不动杆菌的运动,致使生物被膜结构形成缓慢。

鲍曼不动杆菌ATCC17978中第二信使c-di-GMP相关代谢蛋白的生物信息学分析

目的采用生物信息学方法分析鲍曼不动杆菌ATCC17978中第二信使环鸟苷-磷酸(c-di-GMP)相关代谢蛋白,预测其性质和编码功能。方法通过在线数据库NCBI查找鲍曼不动杆菌基因组,从中筛选出含有GGDEF/EAL结构域的蛋白,通过MEGA4.0软件构建进化树进行分析,利用Swiss-Model软件分析该蛋白的三级结构。结果Blast比对显示ATCC17978中含有GGDEF/EAL结构域和c-di-GMP代谢相关的候选蛋白12个,其中含有GGDEF结构域的蛋白10个,含有EAL结构域的蛋白5个,同时含有GGDEF结构域和EAL结构域的蛋白3个。蛋白序列分析含有GGDEF/EAL结构域的蛋白可以分为两类,其中5个蛋白质含有I位点。结构预测分析7个蛋白中含有1个或多个跨膜结构域,其中3个蛋白无跨膜结构域。三级结构预测出9个可信度较高的蛋白。结论鲍曼不动杆菌ATCC17978含有12个与c-di-GMP代谢相关GGDEF/EAL结构域蛋白,为探索c-di-GMP代谢网络奠定了基础。

miR-17-5p靶向自噬相关蛋白ATG7调控巨噬细胞抗结核分枝杆菌感染作用的研究

目的:通过研究miR-17-5p对自噬相关基因ATG7的靶向调控机制和对细胞自噬的作用,探究miR-17-5p在结核分枝杆菌介导的自噬途径中的作用及其机制。方法:生物信息学分析得到miR17-5p的靶基因ATG7,通过成功构建载体ATG7野生型(pMirGLO-ATG7-3'UTR-WT)和突变型,利用双萤光素酶报告系统、Western blot验证miR-17-5p和ATG7的靶向关系,同时构建结核分枝杆菌(H37Ra)感染的人源性THP-1巨噬细胞模型,将做不同处理的细胞分为三组:miR-17-5p mimics、miR-17-5p inhibitor、miR-17-5p nc。通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测H37Ra感染对miR-17-5p表达量的影响,并且进一步通过Western blot、免疫荧光观察检测LC3蛋白的表达量和自噬小体的数量。结果: MTB感染能够引起miR-17-5p的下调,随着感染复数的增加有明显的降低。而生物信息学预测结果显示miR-17-5p与ATG7具有靶向性,双萤光素酶报告实验、Western blot验证miR-17-5p能够和ATG7靶向结合,并对其进行负调控。进一步通过Western blot、免疫荧光观察发现miR-17-5p mimics组LC3Ⅱ的表达下调,自噬小体表达降低,而miR-17-5p inhibitor组相反。其中对H37Ra感染组与未感染组之间比较,ATG7和LC3Ⅱ蛋白表达明显增强。结论: miR-17-5p直接靶向结合ATG7 3'UTR抑制自噬,在巨噬细胞抗MTB过程中发挥作用。

弓形虫Ⅰ型和Ⅱ型ROP16蛋白对人肺腺癌A549细胞增殖、周期和凋亡的影响

目的探讨弓形虫Ⅰ型和Ⅱ型ROP16蛋白对人肺腺癌A549细胞增殖、周期和凋亡的影响及分子机制。方法将构建好的Ⅰ型和Ⅱ型ROP16重组慢病毒表达载体(A549-RH ROP16、A549-Me49ROP16)感染A549细胞,经嘌呤筛选稳定后获得单克隆过表达细胞株。实时荧光定量PCR和Western blot法鉴定过表达效果,免疫荧光法检测其定位。CCK-8法测定A549细胞的增殖活性。流式细胞术检测细胞凋亡和周期变化水平。Western blot法检测细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved Caspases-3、Caspase9、p53和细胞周期相关蛋白p21、CDK6、CyclinD1的蛋白水平。结果Western blot和q-PCR检测结果显示,重组慢病毒表达载体转染A549细胞72h后其ROP16mRNA和蛋白都有明显表达(P<0.05)。cck8检测结果显示,Ⅰ型ROP16蛋白抑制A549细胞增殖(P<0.05)。流式细胞术检测显示,与对照组比较,Ⅰ型ROP16过表达组中细胞凋亡率下降20.69%,G1期细胞百分由原来的63.2%升高到83.2%。Western blot结果显示促细胞周期G1/S转化因子CDK6、CyclinD1蛋白表达明显降低,而细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子p21表达明显升高(P<0.05);促凋亡因子Bax、Cleaved Caspases-3、Caspase9、p53蛋白的表达明显升高,抗凋亡因子Bcl-2表达受到抑制(P<0.05)。而Ⅱ型ROP16过表达组与对照组无显著性差异(P>0.05)。结论Ⅰ型ROP16蛋白过表达可诱导人肺腺癌A549细胞周期停滞和细胞凋亡。

短链脂肪酸对NR8383肺泡巨噬细胞炎性反应的影响

目的探讨短链脂肪酸(SCFAs)在大鼠肺泡巨噬细胞系NR8383细胞中的抗炎作用。方法将3种短链脂肪酸(乙酸盐、丙酸盐及丁酸盐)与NR8383细胞共孵育,然后分别用LPS刺激及肺炎克雷伯杆菌感染NR8383细胞,采用Western blot检测炎性相关蛋白的表达,q-PCR检测炎性相关蛋白mRNA的表达。结果 LPS刺激组丁酸盐预孵育可显著增加NR8383细胞抗炎因子IL-10在3 h及6 h的表达量,以及12 h的TGF-β的表达量,丙酸盐可降低3 h、12 h的iNOS和NF-κB的表达,同时促炎因子TNF-的表达量在LPS刺激6 h后显著降低;q-PCR检测显示,丁酸盐和丙酸盐分别可增加3 h、6 h IL-10 mRNA的表达量(t=4.912,P<0.05),且丁酸盐组表达量>丙酸盐组。与其他两种短链脂肪酸相比丙酸盐降低TNF-mRNA表达的作用更显著(t=13.26,P<0.05)。Kpn刺激组中,与对照组相比丙酸盐可显著增加6 h时抗炎因子IL-10及TGF-β的表达量;丁酸盐可降低3 h和6 h时NF-κB蛋白表达;同时3种短链脂肪酸都可降低6 h的TNF-的表达,以丁酸盐的效应显著;q-PCR检测显示,丁酸盐可显著增加3 h和6 h时IL-10 mRNA的表达量(t=4.41,P<0.05),丙酸盐可显著增加6 h时IL-10 mRNA的表达量(t=5.616,P<0.05)。3种短链脂肪酸都可降低TNF-mRNA的表达,以丁酸盐的效果更显著(t=100.3,P<0.05)。结论短链脂肪酸在NR8383细胞中发挥一定的抗炎效应,尤以丙酸盐和丁酸盐的抗炎效应更显著。

双酶切法构建CRISPR-Cas9载体系统的研究

目的以pet41a质粒为载体骨架,通过酶切连接法构建crispr-cas9载体系统,建立一种简单有效的基因编辑载体,为研究细菌耐药基因的敲除提供方法。方法选择质粒pet41a、pwt-cas9和pgRNA,分析核酸序列,选择合适酶切位点。使用XhoI和BgiII两种限制性内切酶分别酶切pet41a和pwt-cas9,形成带有相同粘性末端的线性载体片段,回收并用T4DNA连接酶连接,连接产物转化DH5α感受态细胞,转化菌涂布含卡那霉素的固体LB培养基平板进行阳性单克隆筛选并测序,构建的质粒命名为pet41-cas9。使用BgiII和XbaI两种限制性内切酶分别酶切pet41-cas9和pgRNA,经回收纯化、连接和转化后筛选阳性单克隆菌落并测序,重组质粒命名为pet41a-cas9-gRNA。分别将重组质粒pet41-cas9和pet41a-cas9-gRNA转化BL-21(DE3),IPTG诱导后提取蛋白进行SDS-PAGE分析。结果测序证实质粒pet41-cas9、pet41a-cas9-gRNA连接正确,载体构建成功。重组质粒粒转染DE3后经IPTG诱导4h,表达相对分子质量为160×103的重组蛋白,与cas9蛋白理论分子质量相符。结论成功构建CRISPR-Cas9载体系统质粒pet41acas9-gRNA并表达重组cas9蛋白,为细菌基因的编辑研究奠定了实验基础。

弓形虫毒力相关效应分子ROP16Ⅲ诱导人肺腺癌A549细胞的基因表达谱

目的利用生物信息学方法分析刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)棒状体蛋白16Ⅲ(ROP16Ⅲ)重组表达载体转染人肺腺癌A549细胞后的基因表达谱,筛选致病候选基因。方法构建真核表达载体pEGFP-N1-ROP16Ⅲ。将A549细胞分为未转染组、pEGFP-N1组、pEGFP-N1-ROP16Ⅲ组,后两组分别用pEGFP-N1、pEGFP-N1-ROP16Ⅲ质粒进行瞬时转染,48 h后收集各组细胞,提取总RNA,纯化后进行芯片杂交分析,筛选差异表达基因(DEG)。将DEG进行基因本体(GO)功能富集分类和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析。利用ToppGene从DEG中筛选弓形虫ROP16Ⅲ致病候选基因。利用STRING在线分析软件对候选基因所编码的蛋白质进行蛋白间相互作用(PPI)网络分析。结果pEGFP-N1-ROP16Ⅲ转染A549细胞后共有566个基因表达差异显著,其中382个基因上调,184个基因下调。对DEG进行生物信息学分析,共获得997条GO注释和50条KEGG信号通路。这些DEG参与了多种生物学过程,包括防御反应、I型干扰素信号通路、先天免疫应答、对外界生物刺激的反应等;参与的信号通路主要集中在抗原处理及呈递,细胞质DNA传感通路,Toll样受体信号通路,NOD样受体信号通路等。ToppGene筛选共获得14个弓形虫ROP16Ⅲ致病候选基因,其中C-X-C基序趋化因子配体11(CXCL11)、Toll样受体3(TLR3)、C-C基序趋化因子26(CCL26)、人类白细胞抗原-E(HLA-E)、早幼粒白血病基因(PML)及信号转导子与转录激活因子2(STAT2)等6个基因在弓形虫方面的研究尚未见报道。PPI网络构建分析发现,DEG编码的蛋白质PPI网络由376个节点(蛋白质)和1152条边(相互作用关系)组成,STAT2、HLA-E和PML位于PPI网络的中心节点处,删除这些关键节点后PPI网络结构涣散。通路富集分析结果显示,CXCL11等6个基因共涉及12条信号通路,主要与趋化因子信号通路、Toll样受体信号通路、程序性坏死、内吞作用及细胞因子-细胞因子受体相互作用等相关,这些生物信号通路可能参与弓形虫ROP16Ⅲ的致病过程。结论本研究筛选发现CXCL11、TLR3、CCL26、HLA-E、PML和STAT2致病候选基因,为进一步探索刚地弓形虫病的致病机制提供了理论依据。

一株杀白细胞素基因阳性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的分子分型及肠毒素检测

目的 对宁夏某医院临床分离的1株杀白细胞素基因阳性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(PVL^(+) MRSA)菌株进行分子分型和肠毒素检测分析,以了解该菌株的遗传学特征。方法 按AxyPrep质粒小量制备试剂盒说明书提取细菌DNA,利用葡萄球菌染色体基因盒mec(staphylococcal cassette chromosome mec,SCCmec)分型、多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)以及金黄色葡萄球菌表面蛋白A基因多态性分型(staphylococcus protein A,Spa)技术对PVL^(+) MRSA分离株进行分子分型。采用PCR法检测金黄色葡萄球菌7个管家基因(arcC,aroE,tpi,pta,glpF,gmk和yqiL),将测序结果与MLST数据库进行比对。采用微孔板酶联免疫法(ELISA)检测PVL^(+) MRSA分离株中5种传统肠毒素(staphylococcal enterotoxins A-E,SEA-SEE)的表达情况。结果 对PVL^(+) MRSA分离株进行SCCmec基因的多重PCR扩增,扩增产物经测序比对分析,确定该菌株为SCCmecⅣa型。PCR扩增金黄色葡萄球菌7个管家基因后测序比对,获得PVL^(+) MRSA分离株的序列型(sequence types,STs)为ST 3191。PCR扩增spa基因并测序,测序结果与Spa Serve数据库比对,未检出PVL^(+) MRSA分离株的Spa型别(non-typeable,NT)。ELISA检测PVL^(+) MRSA分离株产B和C混合型葡萄球菌肠毒素。结论 PVL^(+) MRSA分离株的分子型为ST 3191-MRSA-SCCmecⅣa型,且产B和C混合型葡萄球菌肠毒素,属于社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(CA-MRSA)。