慢病毒载体对MDA-MB-231细胞中microRNA-18a-3P表达的影响

目的构建人microRNA-18a-3P(miR-18a-3P)过表达及干扰慢病毒载体,研究病毒感染人乳腺癌细胞系MDA-MB-231的步骤和方法。方法 PCR技术扩增相应目的基因片段并进行酶切,回收后与目的基因连接,产物转化细菌感受态细胞,对阳性克隆测序行对比分析,构建miR-18a-3P过表达及干扰慢病毒载体,荧光法测定病毒滴定;倒置荧光显微镜观察人乳腺癌细胞MDA-MB-231转染及筛选过程的转染效率,筛选最佳MOI值;qRT-PCR检测慢病毒转染后MDA-MB-231细胞内miR-18a-3P的表达。结果测序分析证实重组慢病毒构建正确;过表达及干扰慢病毒滴度分别为2×10~9和1×10~9 TU/ml;加Polybrene较未加Polybrene转染效率升高,当感染复数为10 TU/ml,Polybrene浓度为1μg/ml时,转染效率最佳;miR-18a-3P转染组过表达miR-18a-3P的相对表达量较空白对照组、阴性对照组高(P<0.05),miR-18a-3P转染组干扰表达miR-18a-3P的相对表达量较空白对照组、阴性对照组低(P<0.05)。结论成功构建了miR-18a-3P过表达及干扰慢病毒表达载体,对人乳腺癌细胞MDA-MB-231进行转染和筛选后,可快速高效率获得所需目的细胞。

PGC-1β基因干扰载体的构建及其对乳腺肿瘤细胞增殖的影响

目的构建过氧化物酶体增殖物激活受体辅助活化因子1β(peroxisome proliferative actives receptorγcoactivator-1β,PGC-1β)基因干扰载体,并将其转入人乳腺肿瘤细胞MCF-7中,验证其干扰效应及对肿瘤细胞增殖的影响。方法应用PCR技术扩增得到人PGC-1β的全长序列,克隆入p GEM-T easy载体中,筛选阳性克隆,经酶切鉴定、测序鉴定证实克隆成功。构建人PGC-1β基因干扰载体,命名为p Genesil/sh PGC-1β。将干扰载体利用Lip3000转至乳腺肿瘤细胞系MCF-7中,通过Real-time PCR、Western blot技术检测外源基因PGC-1β的表达。同时利用MTT、平板克隆形成实验检测转染干扰载体对MCF-7细胞增殖能力的影响。结果经双酶切鉴定证实构建的PGC-1β干扰载体的酶切片段与预期大小一致;Real-time PCR与Western blot结果显示与MCF-7细胞组及转染空载体组相比,转染干扰载体组MCF-7细胞中PGC-1βm RNA与PGC-1β蛋白的表达水平均下降(P<0.05)。平板克隆形成和MTT实验结果表明,转染干扰载体组与空载体组及MCF-7细胞组相比,细胞的增殖能力减弱(P<0.01)。结论成功构建PGC-1β基因干扰载体(p Genesil/sh PGC-1β),转染MCF-7细胞可抑制其增殖能力,为后续深入研究PGC-1β对肿瘤细胞的作用机制奠定了基础。

环状RNA hsa_circ_0018574在结直肠癌组织中的表达及其对结直肠癌细胞增殖的影响

目的探讨hsa_circ_0018574在结直肠癌组织和人结肠癌HT29细胞系中的表达,以及其对结直肠肿瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法使用circPrimer1.2软件绘制circRNA序列结构示意图,用人circRNA芯片筛选在结直肠癌组织和癌旁组织中差异表达的circRNA,提取组织样本RNA,RT-qPCR检测hsa_circ_0018574在人结直肠肿瘤组织中的表达。将si-circ_0018574转染至人结肠癌HT29细胞,分别采用克隆集落形成实验、流式细胞仪、Western blot法检测CDK2、CDK4、CDK6以及cyclinD1和cyclinE周期蛋白表达。结果hsa_circ_0018574在人结直肠肿瘤组织中的表达明显高于癌旁组织(P<0.01)。si-circ_0018574能够明显抑制人结肠癌HT29细胞增殖,减少克隆形成以及降低细胞集落的形成能力(P<0.01),诱导肿瘤细胞凋亡(P<0.01)。CDK2、CDK4、CDK6以及cyclinD1和cyc l inE周期蛋白表达降低。结论hsa_circ_0018574在结直肠肿瘤中高表达,沉默circ_0018574能够显著抑制人结肠癌HT29细胞增殖,减少细胞分裂,诱导细胞凋亡。

Mortalin通过PI3K/AKT通路对人神经胶质瘤细胞U87增殖迁移的影响

目的构建Mortalin慢病毒过表达载体和干扰载体,转染人神经胶质瘤细胞U87,探究Mortalin对U87细胞活力及增殖侵袭效应。方法经PCR技术扩增得到Mortalin过表达片段,引物退火得到Mortalin干扰片段,连接线性表达载体并转染293T细胞后,从293T细胞上清液中获取Mortalin慢病毒载体。通过转染剂(感染增强液)转染U87细胞,在荧光显微镜下观察转染效果,qRT-PCR检测转染Mortalin慢病毒载体后在U87细胞中表达状况。CCK-8实验、克隆实验、划痕实验分别验证Mortalin对U87细胞活力、增殖、迁移的影响,Western blot验证PI3K/AKT蛋白表达。结果成功构建Mortalin慢病毒载体,转染人神经胶质瘤(U87)细胞。与Control组相比,NC组变化差异无统计学意义(P>0.05)。与NC组相比,过表达Mortalin可以提高U87细胞集落形成和迁移能力(P均<0.05),PI3K/AKT蛋白高表达(P<0.05),而干扰组U87细胞则低表达(P<0.05)。结论Mortalin能够提高U87细胞活力,并通过激活PI3K/AKT信号通路促进细胞增殖、迁移。