犬细小病毒宁夏株的分离与鉴定

本试验采集宁夏地区疑似犬细小病毒感染病犬的粪便拭子,经过预处理后同步接种胎猫肾细胞(FK81),盲传3代后发现FK81细胞出现明显的细胞毒性改变(CPE)。冻融收获病毒后,对分离出来的病毒进行电镜观察、间接免疫荧光试验(IFA)检测、特异性PCR鉴定及VP2全基因序列扩增分析,成功分离培养出1株犬细小病毒(CPV)。

抗幽门螺杆菌UreB重组全人源化单域抗体的基因工程表达及分子改造

为了构建针对幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)脲酶的单域抗体的基因工程表达系统。首先利用Pymol、ITASSER和ClussPro2等AI辅助工具分析比较了不同抗体与Hp脲酶亚单位B(UreB)之间的分子间作用力,确定了VL全人源化单域抗体UreBAb作为重点研究对象。根据大肠埃希菌密码子偏好性优化了UreBAb基因序列,并将其分别插入pET28a、pE-SUMO等表达载体,转化大肠埃希菌Rosetta(DE3)获得了重组表达菌株,通过IPTG诱导制备重组抗体蛋白,并利用提取的Hp脲酶作为抗原,分析验证了重组表达抗体的活性。SDS-PAGE检测结果显示UreBAb和SUMO-UreBAb均获得了正确的表达,纯化后的蛋白产率分别为0.34和0.41 mg/mL。单向免疫扩散实验结果证实这两种重组表达抗体均与Hp UreB抗原具有良好的亲和力,对脲酶的抑制率分别为51.27%和74.07%。进而,结合AlphaFold2、cluspro2、mCSM-AB、OSPREY和FoldX等人工智能工具,评估分析了影响抗原-抗体复合物稳定性的关键位点及其突变策略,随后进一步构建了9个UreBAb进化突变体表达菌株,活性分析结果显示,这些突变体与抗原的结合活性均得到了提高,其中以I107W突变体的活性提升最为显著,相较于野生型UreBAb,提高了24.95%。本研究为Hp全人源化单域抗体的开发奠定了良好的基础。

pSicoR/miR-17-5p靶向调控UNC-51样激酶1(ULK1)及其对细胞自噬的影响

目的为了探讨miR-17-5p对自噬相关基因ULK1的调控作用及其对细胞自噬的影响,为更深入研究miR-17-5p调控细胞自噬机制建立理论依据。方法构建p Sico R-miR-17-5p过表达重组质粒,包装miR-17-5p过表达慢病毒,构建ULK1及其突变体ULK1-mut的pmiR-report载体,通过双荧光素酶报告系统验证miR-17-5p对ULK1的靶向关系,利用Western blot检测ULK1与LC3B蛋白的表达量。结果成功构建p Sico R-miR-17-5p过表达重组质粒并且成功将ULK1及其突变体ULK1-mut的3′-UTR插入到pmiR-report载体中;双荧光素酶报告系统结果表明转染miR-17-5p及ULK1-3′-UTR,miR-17-5p过表达组相比对照组相对荧光强度降低1.9倍(P<0.05),说明miR-17-5p对ULK1的表达有抑制作用,而转染miR-17-5p及mut-ULK1-3′-UTR之后检测显示相对荧光强度并没有降低,说明miR-17-5p是靶向作用于ULK1,并对其进行负调控;Western blot显示miR-17-5p抑制ULK1蛋白的表达,并且抑制LC3II/I蛋白的表达。结论 miR-17-5p直接靶向作用于自噬相关基因ULK1,并且对其负调控,抑制细胞自噬的发生。

幽门螺旋杆菌重组尿素酶B亚基的纯化及其免疫学性质的研究(英文)

目的:幽门螺旋杆菌(Hp)尿素酶是Hp重要的定制因子和致病因子,Hp尿素酶活性位点位于Hp尿素酶B亚基(Ure B),研发基于Ure B的Hp疫苗是一种很有前景的防治Hp感染的策略。方法:主要利用基因克隆技术从幽门螺旋杆菌标准菌株SS1(Hp SS1)获得Hp尿素酶B亚基基因,并构建含有重组Hp尿素酶B亚基(rU reB)基因的重组表达载体p ET-rU re B及其重组菌株;重组菌株经蛋白表达和优化后,利用Ni-NTP镍离子亲和层析和DEAE Sepharose FF阴离子交换层析纯化重组尿素酶B亚基(rU re B),并进一步通过腹腔注射免疫BALB/c小鼠,研究rU re B的免疫学性质。结果:通过基因克隆技术成功获得了Hp尿素酶B亚基基因,并成功构建了重组表达载体p ET-rU re B及其重组菌株BL21(DE3)/p ET-rU re B,经蛋白表达优化及纯化,可获得高纯度(96.5%)的重组蛋白rU re B。重组蛋白rU re B辅以弗氏佐剂腹腔注射免疫BALB/c小鼠,经间接ELISA鉴定小鼠能够产生针对天然Hp尿素酶和Ure B的高滴度特异性抗体,且能够显著性抑制Hp尿素酶的活性。结论:重组Hp尿素酶B亚基能够在大肠杆菌表达系统中获得较高水平的表达,具有较高的免疫学特异性,其抗体能够有效抑制Hp尿素酶活性。为研究基于尿素酶的防治Hp感染的Hp疫苗奠定了一定的实验基础。