miR-23a-3p通过调控靶基因Gja1参与调控大鼠卵泡闭锁及颗粒细胞凋亡

目的探讨miR-23a-3p在大鼠卵泡闭锁及卵巢颗粒细胞凋亡过程中的作用机制。方法分别在SD大鼠卵巢囊中注射miR-23a-3p模拟物/抑制剂,转染72 h后,采用HE染色法检测大鼠卵巢组织形态变化及闭锁卵泡数变化情况;采用生物信息学及荧光素酶报告系统预测并验证miR-23a-3p的靶基因及其结合位点;体外分离培养大鼠卵巢颗粒细胞,并分别转染miR-23a-3p模拟物及抑制剂,采用荧光定量PCR(RT-PCR)法检测转染72 h后颗粒细胞中miR-23a-3p及其靶基因缝隙连接蛋白43(Gja1)的表达情况;Gja1干扰慢病毒转染大鼠颗粒细胞,转染72 h后,采用RT-PCR和Western blot检测大鼠卵巢颗粒细胞中Gja1在mRNA和蛋白水平的表达情况;用流式细胞术检测转染miR-23a-3p模拟物/抑制剂、Gja1干扰慢病毒后卵巢颗粒细胞的凋亡情况。结果HE染色结果显示,大鼠卵巢囊注射miR-23a-3p模拟物后卵巢中的闭锁卵泡数量显著增高于模拟物对照组(P<0.05);双荧光素酶报告实验发现,转染miR-23a-3p模拟物组显著降低了荧光素酶活性(P<0.05);RT-PCR结果显示,转染miR-23a-3p模拟物后卵巢颗粒细胞中miR-23a-3p的表达显著增加,Gja1则显著降低(P<0.05),而转染miR-23a-3p抑制剂后对内源性miR-23a-3p和Gja1的表达无显著影响(P>0.05);用Gja1慢病毒干扰载体/对照载体分别转染大鼠卵巢颗粒细胞72 h后,RT-PCR和Western blot结果显示,Gja1干扰组Gja1在mRNA水平及蛋白水平均显著低于对照组(P<0.05);Western blot检测结果显示,转染miR-23a-3p模拟物后卵巢颗粒细胞中Gja1的表达显著降低(P<0.05);流式细胞术检测发现,转染miR-23a-3p模拟物后显著促进了卵巢颗粒细胞凋亡,下调Gja1后卵巢颗粒细胞凋亡率显著增加(P<0.05)。结论miR-23a-3p通过调控靶基因Gja1参与调节大鼠卵泡闭锁及卵巢颗粒细胞的凋亡。

小鼠动情周期卵巢、子宫及输卵管中氧化应激水平及意义

目的探讨小鼠动情周期不同阶段氧化应激(OS)的变化规律及对雌性生殖的作用。方法应用ELISA方法检测动情周期各阶段血清中的丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)、8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)及超氧化物歧化酶(SOD),应用免疫组化方法检测DNA修复蛋白8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1(OGG1)及超氧化物歧化酶1(SOD1)在动情周期各阶段输卵管和子宫角中的表达定位,实时荧光定量(PCR)及Western blot检测动情周期各阶段卵巢和子宫角中的OGG1及SOD1基因及蛋白表达水平。结果ELISA结果显示,动情期血清MDA和8-OHdG高于间情期、动情后期及动情前期(P均<0.05),动情前期血清GSH高于动情期、动情后期及间情期(P均<0.05),但是血清总SOD水平在动情周期四个阶段间差异无统计学意义(P均>0.05);PCR和Western blot结果显示,动情期卵巢和子宫角中的SOD1和OGG1 mRNA和蛋白水平低于间情期(P均<0.05),而免疫组化结果显示:OGG1和SOD1蛋白主要定位于子宫内膜腔上皮和腺上皮细胞,定位于输卵管上皮细胞,且SOD1和OGG1在动情期的输卵管中高表达。结论动情周期中OS水平的动态变化提示OS可能参与雌性生殖,特别是排卵、受精过程,且与动情周期雌孕激素的变化密切相关。