重组幽门螺旋杆菌黏附素A的可溶性表达、纯化及其免疫学性质分析

目的 通过分子克隆、蛋白表达及纯化等技术获得重组幽门螺旋杆菌黏附素A(recombinant H.pylori adhesin A,rHpaA),免疫BALB/c小鼠,制备anti-HpaA多克隆抗体后,分析其抗体特异性。方法 利用Phyre2和DNAstar生物信息学软件分析rHpaA的三维结构及抗原性质;通过PCR长片段DNA合成技术获得黏附素HpaA基因,插入质粒pCzn1中,制备重组质粒pCzn1-rHpaA,转化E.coli Arctic Express(DE3),经IPTG诱导表达、Ni-IDA亲和层析纯化后,获得rHpaA蛋白,Western blot鉴定其反应原性。将rHpaA辅以弗氏佐剂免疫雄性BALB/c小鼠,共6只,制备antiHpaA多克隆抗体,ELISA法鉴定其抗体特异性。结果 rHpaA具有较好的三维结构及抗原性质。双酶切鉴定及基因测序证明,重组质粒pCzn1-rHpaA含有完全正确的HpaA基因序列。重组菌株pCzn1-rHpaA/Arctic Express可溶性表达目的蛋白rHpaA,约占上清总蛋白的68.3%,纯度达98.1%。rHpaA可与anti-His和anti-H.pylori抗体相结合;antiHpaA多克隆抗体可特异性识别rHpaA和H.pylori裂解物。结论 经低温诱导表达和蛋白纯化等技术,可获得高纯度目的蛋白rHpaA,制备的anti-HpaA多克隆抗体具有良好的特异性,为研究H.pylori相关诊断试剂奠定了实验基础。

幽门螺旋杆菌重组抗原表位肽C-CagAL构建及其多克隆抗体特异性分析

[目的]制备幽门螺旋杆菌重组抗原表位肽C-CagAL,并分析其多克隆抗血清的特异性。[方法]用分子克隆技术构建重组表达质粒pETC-CagAL,将其转入大肠杆菌中表达,利用Ni-Agarose亲和层析纯化目的蛋白C-CagAL;免疫BALB/c小鼠,制备抗C-CagAL多克隆抗血清,通过ELISA方法分析抗血清的特异性。[结果]DNAstar等软件表明C-CagAL具有较好的抗原性,Linker易形成转角或β-折叠,为柔性结构;重组抗原C-CagAL经大肠杆菌表达,约56kDa,占菌体总蛋白的19.82%,经Ni-Agarose亲和层析纯化,获得纯度为97.5%的重组抗原C-CagAL;抗C-CagAL多克隆抗血清能够特异性识别CagA和CagL。[结论]获得了一种能够激发抗CagA和CagL特异性抗体的重组抗原表位肽C-CagAL,为进一步研究其预防幽门螺旋杆菌感染的免疫效果奠定了基础。

幽门螺杆菌多价表位疫苗CWAE的表达及其免疫学性质的研究

目的:利用生物信息学软件评价幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)多价表位疫苗CWAE的抗原结构,经原核表达获得高纯度CWAE蛋白,进而鉴定多价表位疫苗CWAE的免疫学性质。方法:通过生物信息学软件分析H. pylori多价表位疫苗CWAE的抗原结构;用人工合成的H. pylori多价表位肽融合基因WAE替换重组质粒pET28a-CUE中的UE基因,构建重组质粒pET28aCWAE。然后,将pET28a-CWAE转入大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,并通过Ni-NTP镍离子亲和层析纯化抗原蛋白CWAE;利用GM1-ELISA鉴定CWAE中CTB组分的黏膜免疫佐剂活性。最后,通过ELISA和小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验检测CWAE激发BALB/c小鼠产生抗H.pylori抗体体液免疫和淋巴细胞免疫应答的能力。结果:通过生物信息学软件证实H. pylori多价表位疫苗CWAE具有科学合理的结构;重组表达质粒pET28a-CWAE经PCR、双酶切和基因测序鉴定,融合基因CWAE与设计序列完全一致;重组基因工程菌株pET28a-CWAE/BL21(DE3)经IPTG诱导表达,抗原蛋白CWAE主要以包涵体形式存在,经Ni-NTP镍离子亲和层析纯化,纯度约达93. 2%;GM1-ELISA实验证实,CWAE中CTB组分依旧保持有较好的黏膜佐剂活性;ELISA结果证实CWAE能够激发BALB/c小鼠产生H. pylori特异性抗体,而小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验进一步证实CWAE能够激发针对H. pylori多种致病因子的淋巴细胞免疫反应。结论:H. pylori多价表位疫苗CWAE具有科学合理的抗原结构,经原核表达可获得高纯度抗原蛋白,能够激发BALB/c小鼠产生H. pylori特异性抗体体液免疫和淋巴细胞免疫应答。为研发防治H. pylori感染的多价表位疫苗奠定实验基础。

幽门螺杆菌致病岛CagL重组抗原的可溶性表达及其多克隆抗体的制备和分析

目的:利用原核表达和蛋白质纯化技术获得高纯度的幽门螺杆菌致病岛CagL重组抗原(rCagL),利用其制备anti-CagL多克隆抗体,并分析抗体的特异性。方法:通过生物信息学软件分析rCagL的抗原结构;利用PCR长片段DNA合成技术合成不含有信号肽序列的幽门螺杆菌致病岛CagL基因,将其插入表达质粒p Czn1中,构建重组质粒pCzn1-rCagL。然后,将pCzn1-rCagL转入大肠杆菌Arctic Express中,经IPTG诱导表达后,通过Ni-IDA镍离子亲和层析纯化重组抗原rCagL,利用Western blot鉴定rCagL与His标签抗体和Anti-H.pylori抗体的免疫反应性;最后,通过rCagL辅以弗氏佐剂免疫BALB/c小鼠,制备anti-CagL多克隆抗血清,通过ELISA方法分析抗血清的特异性。结果:生物信息学软件表明重组抗原rCagL具有较好的抗原性质;重组质粒pCzn1-rCagL经双酶切和基因测序等技术鉴定,证实rCagL核苷酸序列与理论序列完全一致;基因工程菌株pCzn1-rCagL/Arctic Express在低温11℃条件经IPTG诱导表达。SDS-PAGE实验结果证实:rCagL可实现相对高效地可溶性蛋白表达,可溶性蛋白约占包涵体的62.07%。经Ni-IDA亲和层析柱纯化,可获得高纯度rCagL,纯度约为96.6%。Western blot结果证实:重组抗原rCagL可特异性与His标签抗体和Anti-H.pylori抗体结合。ELISA结果证实:经rCagL免疫小鼠制备的多克隆抗体anti-CagL可特异性识别rCagL和H.pylori裂解物,具有较高的抗体特异性。结论:重组抗原rCagL在低温条件下可实现可溶性表达,经纯化可获得高纯度抗原蛋白;rCagL具有较好的抗原性,制备的多克隆抗体具有较好的免疫特异性,为发展H.pylori相关诊断试剂奠定了实验基础。

幽门螺旋杆菌脂蛋白Lpp20重组抗原的可溶性表达及其免疫学性质分析

[目的]利用原核表达系统表达幽门螺旋杆菌脂蛋白Lpp20(rLpp20),分离纯化获得重组融合蛋白rLpp20,利用其制备抗rLpp20多克隆抗体,并分析其抗体的特异性。[方法]利用生物信息学软件分析rLpp20的抗原结构;通过拼接引物PCR法,获得幽门螺旋杆菌Lpp20基因序列,将其插入到质粒pCzn1中,构建重组质粒pCzn1-rLpp20,转入大肠杆菌Arctic Express中;经IPTG诱导表达rLpp20后,超声波裂菌,用Ni-IDA柱亲和纯化获得目的蛋白rLpp20。然后,利用Western Blot鉴定rLpp20与anti-H.pylori和anti-His tag的免疫反应性;最后,脂蛋白重组抗原rLpp20与弗氏佐剂混合,免疫BALB/c小鼠,制备anti-Lpp20多克隆抗血清,利用ELISA鉴定anti-Lpp20的抗体特异性。[结果]利用生物信息学软件证实rLpp20具有较好的抗原性;重组质粒pCZN1-rLpp20经双酶切和基因测序鉴定,证实rLpp20序列与理论值一致;基因工程菌株pCzn1-rLpp20/Arctic Express可以以可溶形式表达rLpp20,经Ni-IDA亲和层析柱纯化,纯度约达98.2%。Western Blot结果证实:重组抗原rLpp20可特异性与anti-H.pylori和anti-His tag结合。ELISA结果证实:所制备的anti-Lpp20抗血清具有良好的抗体特异性,可特异性识别rLpp20和H.pylori裂解物。[结论]利用E.coli Arctic Express实现了脂蛋白重组抗原rLpp20的可溶性表达,经Ni-IDA柱亲和纯化获得了高纯度rLpp20;脂蛋白重组抗原rLpp20具有良好的免疫反应性和特异性,为进一步研制幽门螺旋杆菌疫苗及相关诊断试剂盒奠定了良好的实验基础。