癫痫大鼠小胶质细胞活化与P2Y12受体的表达及Purα的影响

目的研究急性癫痫状态下小胶质细胞活化与P2Y12受体的表达,以及Purα对P2Y12受体表达的影响。方法用免疫组织化学方法检测大鼠急性癫痫持续状态后不同时间点海马组织中由IBA1标记的小胶质细胞的活化;用Western blot检测癫痫状态下海马组织中P2Y12受体和Purα的表达水平,以及检测Purα在癫痫状态下对P2Y12受体表达水平的影响。结果癫痫组大鼠海马组织中的小胶质细胞被激活,表现为胞体增大、数量增多、突起数量增多且长度变短。癫痫不同时间点小胶质细胞活化的程度不同,癫痫2h时,小胶质细胞活化最为明显;癫痫4h时,活化的小胶质细胞数量开始减少;癫痫8h时,小胶质细胞活化程度最低。随着癫痫状态的持续,P2Y12受体表达水平呈现先上升后下降趋势,在癫痫3h时其表达水平最高,与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。癫痫持续2h时,Purα过表达组的P2Y12受体的表达水平高于对照组(P<0.05),Purα沉默组的P2Y12受体的表达水平低于对照组和正常组(P均<0.05)。结论癫痫持续状态下,小胶质细胞发生活化;P2Y12受体的表达与小胶质细胞活化状态有关;Purα能够上调P2Y12受体的表达水平。

Purα蛋白质不同结构域对APP基因表达的调控作用

该研究将构建的含淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)基因启动子的萤火虫荧光素酶报告质粒与Purα全长基因或含不同结构域的Purα缺失突变体共转染到U87MG细胞中,进行萤火虫荧光素酶活性测定,以确定Purα对APP基因表达的调控作用。同时,将Purα全长基因及含有不同结构域的Purα缺失突变体的真核表达载体分别转染至U87MG细胞,使目的蛋白过表达,通过实时定量PCR(Real-time PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)研究Purα不同的结构域对APP基因在转录、翻译水平的调控作用。结果显示,Purα全长蛋白及其不同结构域对APP基因表达均有不同程度的抑制作用,但至少保持N-端或C-端的结构域可能是维持Purα蛋白功能的必要条件。

神经调控岛叶治疗药物成瘾的研究进展

药物成瘾是一种慢性复发性脑疾病,目前治疗方法有限,且复发率极高。神经调控技术,包括重复性经颅磁刺激(rTMS)、经颅直流电刺激(tDCS)和脑深部电刺激(DBS),在治疗药物成瘾方面具有很好的治疗前景。岛叶是药物成瘾的关键脑区,其作为神经调控靶区在药物成瘾中的价值需要进一步探索。本文介绍了岛叶在药物成瘾中的作用的临床前和临床证据,探讨了其作为脑刺激靶点治疗药物成瘾的前景。

应用CRISPR/Cas9技术敲除小鼠海马神经元中Purα基因可减弱神经元对DNA损伤的修复作用

人转录活化因子Purα是体内重要的转录因子,在体内多个环节中都发挥着重要的作用,尤其是在神经系统中,它与神经元的发育,突触形成都有很密切的关系。该文通过构建Purα基因敲除的小鼠海马神经元细胞系来观察其在DNA损伤修复中的作用。根据目的基因靶向删除外显子的位置设计相应的sg RNA序列,合成相应的寡核苷酸后克隆在p Sp Cas9(BB)-2A-Puro(PX459)V2.0质粒载体相应位点上,从而构建能对Purα基因进行敲除的CRISPR/Cas9质粒,将构建好的质粒通过酶切和测序进行鉴定,将经过鉴定证实相位正确及在有sg RNA序列插入的阳性质粒转染到小鼠海马神经元(HT22)细胞中,加入嘌呤霉素进行抗性筛选,保留正常生长的细胞进行培养,从而建立能稳定地进行Purα基因敲除的细胞系。通过Real-time PCR和Western blot技术分别在转录和翻译水平上检测Purα基因的表达情况,从而来判定Purα基因的敲除效率;将所构建的Purα基因敲除的细胞用羟基脲(HU)进行处理来建立细胞DNA损伤的实验模型,通过Western blot、脉冲电场反转凝胶电泳实验及细胞毒性实验观察Purα在DNA损伤修复中的作用。实验结果证实,所插入片段相位正确。通过TA克隆测序和T7E1酶切证实所构建的质粒具有良好的CRISPR/Cas9活性,可导致基因组碱基发生突变,Real-time PCR和Western blot实验结果证实,Purα基因敲除组的Purα基因表达明显降低。Purα基因敲除后,细胞对HU引起的DNA损伤极为敏感,说明Purα在维持基因组DNA的完整性方面发挥着重要的作用,是细胞中一种不可或缺的蛋白质。该实验结果还提示,利用CRISPR/Cs9技术可以有效地对目的基因进行敲除,同时由于该质粒携带有嘌呤霉素抗性基因,利用这一特点,可以方便地建立稳定的细胞系,该细胞系可用作研究Purα基因在神经元中的生物学功能的细胞模型。

k252a抑制BDNF—TrkB信号传导通路对电刺激点燃大鼠Arc表达及癫痫发生的影响

目的探讨BDNF—TrkB信号传导通路与杏仁核电刺激点燃大鼠Arc表达及癫痫发生的关系。方法雄性sD大鼠随机分为空白组、假手术组、杏仁核点燃组（单纯点燃组、k252a注射组、DMSO对照组）。应用Mpha—Lab4通道信号采集及处理系统记录大鼠脑电活动。运用免疫组化检测其Arc蛋白的表达水平，采用RT—PCR、原位杂交检测ArcmRNA在海马中表达水平。结果k252a注射组大鼠V级发作持续时间（33．00±1．41）s显著低于单纯点燃组（60．50±2．07）s、DMSO对照组（60．00±1．79）s大鼠V级发作持续时间（P〈0．01）。k252a注射组3h、6hArc阳性细胞百分率显著低于单纯点燃组、DMSO对照组3h、6hArc阳性细胞百分率（P〈0．01），12h时5组间Arc阳性细胞百分率相比表达差异无统计学意义（F=0．684，P〉0．05）。RT—PCR、原位杂交结果显示：k252a注射组1h、3hArcmRNA表达量显著低于单纯点燃组、DMSO对照组1h、3hArcmRNA表达量（P〈0．01）。6h时5组间ArcmRNA相比表达差异无统计学意义（P〉0．05）。结论k252a能够抑制BDNF—TrkB信号传导通路对Arc表达的诱导作用从而使癫痫发作的持续时间缩短。