共培养体系下牛骨骼肌细胞对脂肪细胞的调控作用研究

【目的】大理石纹是衡量肉品质的重要指标之一,由牛骨骼肌细胞与牛脂肪细胞共同发育形成。通过最大程度模拟体内肉质形成过程中牛骨骼肌细胞和脂肪细胞互作效应,建立体外两种细胞共培养体系,探究共培养体系下牛骨骼肌细胞分泌和代谢因子对脂肪细胞的调控作用。【方法】采用组织块法和酶消化法分别分离牛脂肪细胞和骨骼肌细胞。利用表型鉴定法和标志基因表达谱鉴定法共同鉴定所分离细胞的纯度和分化潜能,进一步构建牛骨骼肌细胞和牛脂肪细胞条件培养基交换共培养体系以及Transwell共培养体系,通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)、EdU染色和油红O染色等方法检测共培养条件下牛骨骼肌细胞分泌和代谢产物对脂肪细胞增殖和分化的影响。【结果】成功构建了两种牛骨骼肌细胞与脂肪细胞的共培养体系。条件培养基交换共培养下,牛脂肪细胞增殖标志基因PCNA、CDK2、CCNE2和CCND1的表达极显著下调(P<0.01);此外,成脂标志基因FABP4和PPARγ的表达显著下调(P<0.05);LPL的表达极显著下调(P<0.01)。另一方面,在Transwell共培养条件下,牛脂肪细胞增殖标志基因CCND1的表达显著下调(P<0.05);PCNA、CDK1和CCNE2的表达极显著下调(P<0.01),且成脂标志基因FABP4的表达显著下调(P<0.05),PPARγ、C/EBPβ和LPL的表达极显著下调(P<0.01)。【结论】牛骨骼肌细胞分泌和代谢产物可通过抑制脂肪细胞增殖标志基因PCNA、CDK1、CDK2、CCNE2和CCND1以及成脂标志基因PPARγ、FABP4、C/EBPβ和LPL的表达抑制牛脂肪细胞的增殖与分化。以上研究结果可为进一步探究肉牛肌内脂肪沉积的分子机制提供技术支撑。

荷斯坦奶牛DPP6和PRKN基因的生物信息学及表达规律分析

【目的】旨在探究前期GWAS筛选出的与荷斯坦奶牛产奶相关的二肽基肽酶样6(Dipeptidyl Peptidase⁃like 6,DPP6)和E3泛素连接酶基因(Parkin gene,PRKN)的生物学性质及表达特性,为后续验证DPP6和PRKN基因对于荷斯坦奶牛相关调控机制研究提供基础。【方法】利用ProtParam、Phyre2、NetPhos 3.1等软件分析DPP6和PRKN的理化性质与蛋白结构,并采用实时荧光定量PCR(Real⁃Time quantitative PCR,RT⁃qPCR)检测DPP6和PRKN基因在荷斯坦奶牛的心脏、脾脏、肝脏、肺脏、肾脏、乳腺、子宫、卵巢、瘤胃、黄体10个组织中的表达规律;通过脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导乳腺上皮细胞(bMECs),初步检测DPP6和PRKN基因在炎症反应中的表达模式。【结果】DPP6蛋白编码863个氨基酸,与山羊的亲缘关系最近;PRKN蛋白编码488个氨基酸,其中甘氨酸含量最多,其序列与马鹿的相似性最高,保守型较强。本研究推测2个物种的DPP6和PRKN蛋白可能具有相似的生物学功能,并且2个蛋白均属于不稳定亲水性蛋白。DPP6和PRKN基因在组织中普遍表达。其中,DPP6基因在乳腺、肺脏、脾脏以及肾脏组织中的表达量显著高于其他组织,而PRKN基因在乳腺、肾脏、瘤胃组织中显著高表达。此外,相比于空白对照组,DPP6与PRKN基因均能够在LPS诱导的bMECs中极显著表达(DPP6基因极显著下调,PRKN基因极显著上调)。【结论】DPP6与PRKN基因可能在调控荷斯坦奶牛乳房炎症过程中发挥潜在作用,为后期荷斯坦奶牛DPP6与PRKN两个基因在奶牛bMECs炎症反应相关调控机制研究提供理论依据。