牛FoxO 1基因CDS区克隆及其在脂肪细胞分化过程中的表达分析

本试验旨在克隆牛叉头转录因子O1(Forkhead box O1,FoxO 1)基因编码区序列并探究其在牛脂肪细胞分化过程中的表达规律。利用PCR扩增牛FoxO 1基因CDS区序列,通过生物信息学方法预测牛FoxO1的理化特性和功能,并运用实时荧光定量PCR技术检测牛脂肪细胞不同分化阶段FoxO 1和脂肪标志基因PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ、FABP 4和LPL的表达规律。结果显示,牛FoxO 1基因的CDS区全长1998 bp,编码665个氨基酸,其蛋白分子式为C_(3016)H_(4711)N_(871)O_(979)S_(35),理论等电点为6.38。预测发现,FoxO1与脂肪生长发育调控蛋白AKT1、AKT2、AKT3、SIRT1、PRKACA、CDK2和MAPK8等之间存在紧密互作关系。系统进化树结果显示,牛FoxO1进化保守,与亲缘关系较近的绵羊和山羊物种同源性最高。检测牛脂肪细胞不同分化时期基因的时序表达,结果显示,与分化第0天相比,牛FoxO 1基因在第6天表达量达到峰值(P<0.01),随后下调;PPARγ和C/EBPβ均在第0天就有较高的表达量,且二者在诱导分化第4、6天表达量都极显著高于第0天(P<0.01);C/EBPα的表达量在分化第2、4、6和10天都极显著高于第0天(P<0.01);FABP 4在分化第0、2天表达量较低,于分化第4天表达量上升达峰值(P<0.01),随后逐渐下调(P<0.05);LPL随分化进程推进其表达量不断上升,于分化第10天达到峰值(P<0.01)。以上研究结果可为进一步探究FoxO 1调节牛脂肪生成的分子机制提供参考信息。

牛FoxO1基因启动子转录调控分析

为鉴定牛叉头框转录因子1(Forkhead box,FoxO1)的核心启动子区及其关键转录因子,利用PCR扩增牛FoxO1基因的启动子序列,同时设计7个逐段缺失片段引物扩增其启动子逐段缺失片段,进一步将其构建双荧光素酶报告载体并分别转染小鼠C2C12和3T3-L1细胞系,通过检测不同缺失片段荧光素酶报告载体的活性,以确定牛FoxO1启动子的核心区域;使用Genomatix和JASPAR在线软件预测牛FoxO1基因启动子核心区域的关键转录因子,采用定点突变试验在小鼠C2C12细胞系中初步鉴定预测的关键转录因子对FoxO1的转录调控作用。结果表明:1)成功扩增了牛FoxO1的启动子区1920bp序列,获得了FoxO1基因启动子序列的7个逐段缺失片段序列;2)经双荧光素酶报告试验进一步证实,牛FoxO1基因核心启动子位于-285/-27区域;3)预测并通过定点突变试验鉴定出MEF2A、KLF4、HOXA5和KLF5转录因子对FoxO1基因的转录活性具有关键调控作用。综上,本研究初步鉴定出牛FoxO1基因启动子核心区(-285/-27)内转录因子MEF2A、KLF4、HOXA5和KLF5对FoxO1基因有重要的转录调控作用,为FoxO1基因对牛肌肉脂肪发育过程中的转录调控机制奠定了一定理论基础。