滩羊前体脂肪细胞的体外分离及载体构建

为了研究滩羊肌内脂肪的分化机制,试验选用在脂肪沉积和代谢过程中的关键候选基因长链脂酰辅酶A合成酶3(long-chain acyl-CoA synthetase 3,ACSL3)进行细胞水平的功能验证。采集成年母滩羊的腹股沟脂肪组织,利用胶原酶法分离出前体脂肪细胞,MTT法对细胞活力进行测定,诱导前体脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞进行油红O染色;通过在线软件对ACSL3基因进行生物信息学分析,采用同源重组法构建ACSL3基因的过表达载体,并利用限制性内切酶ApalⅠ和NotⅠ进行酶切鉴定;采用脂质体介导法进行细胞转染。结果表明:用成年母滩羊的成熟脂肪细胞体外分离出了前体脂肪细胞,细胞形态良好,在第2~4天增殖最快,油红O染色后的细胞出现红色圆形脂滴;ACSL3基因的氨基酸数为720个,相对分子质量为80 114.67,ACSL3蛋白为亲水性蛋白,包含一个跨膜区,α-螺旋和无规则卷曲贯穿于整个氨基酸链;用构建的ACSL3基因过表达载体YOE-RP006-ACSL3转染前体脂肪细胞后,可出现绿色荧光。说明可以从成年滩羊的成熟脂肪细胞中分离出前体脂肪细胞,构建的细胞模型良好,ACSL3基因过表达载体可以被成功转染至细胞中,可用于进一步研究ACSL3基因对前体脂肪细胞成脂分化的影响。