基于根表真菌群落与病原菌鉴定探究‘宁杞5号’枸杞根腐病的发生机制

【目的】比较两种植区易感病品种‘宁杞5号’枸杞健康株和患病株的根表真菌群落组成和分离到的腐根真菌,明确‘宁杞5号’根腐病的病原菌,探究两种植区‘宁杞5号’根腐病的发生原因。【方法】采用高通量测序技术研究枸杞根表真菌群落的组成特征,采用组织分离法从两种植区枸杞腐根中分离腐根真菌,基于形态学和ITS、EF-1α基因序列对腐根真菌进行分类学鉴定,依据科赫法则进行致病性研究。【结果】两种植区‘宁杞5号’枸杞健康株和患病株之间的根表真菌群落组成均表现出明显差异,主要体现在患病后镰刀菌属(Fusarium)相对丰度升高,被孢霉属(Mortierella)相对丰度降低,伴随着Fusicolla和Pseudogymnoascus等未知类群丰度增加,而两种植区健康株根表真菌群落结构趋于一致。自QXBZ腐根分离到36株真菌,分别鉴定为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、腐皮镰刀菌(F.solani)、红贝俄式孔菌(Earliella scabrosa)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)和Penicillium pimiteouiense,自QTBZ腐根分离29株真菌,分别鉴定为尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、红贝俄式孔菌、粉红黏帚菌(Clonostachys rosea)、P.pimiteouiense、新知镰刀菌(F.andiyazi)、桃色顶孢霉(Acremonium persicinum),其中腐皮镰刀菌的分离频率在两种植区均为最高,尖孢镰刀菌次之。回接实验确定腐皮镰刀菌、尖孢镰刀菌、新知镰刀菌和立枯丝核菌是‘宁杞5号’枸杞根腐病的病原菌,其中新知镰刀菌为新发现的枸杞根腐病病原菌。【结论】‘宁杞5号’根腐病发生主要与根表真菌群落结构改变以及病原菌种类密切相关,与种植区关系不大,F.solani、F.oxysporum、F.andiyazi和R.solani是‘宁杞5号’根腐病的病原菌。

枸杞外泌体对非小细胞肺癌A549细胞的增殖抑制和凋亡的调控作用

为阐明枸杞外泌体对非小细胞肺癌细胞A549的增殖抑制和凋亡的调控作用,通过超速离心法提取枸杞外泌体,通过透射电镜检测外泌体的形态,粒径分析检测外泌体的直径分布。用提取到的枸杞外泌体作用于A549细胞,通过CCK-8法检测枸杞外泌体对A549细胞的增殖影响,EdU检测枸杞外泌体对A549细胞的活性影响,细胞划痕、Transwell检测细胞的迁移效率,细胞克隆法检测细胞的克隆能力。流式细胞术检测细胞的凋亡率,用Western Blot和qRT-PCR法检测细胞凋亡通路的蛋白和基因表达。结果表明,提取的枸杞外泌体在电镜下呈茶托状,大小在40~200 nm,符合外泌体形状特征。与对照组相比,枸杞外泌体组能够浓度依赖性地抑制A549细胞增殖(P<0.01)。不同浓度枸杞外泌体处理组的细胞迁移能力和细胞克隆能力也呈浓度依赖性下降(P<0.01),而细胞凋亡率呈浓度依赖性增多(P<0.01)。枸杞外泌体能够浓度依赖性地上调Cl-Caspase3、p53、Bax等促凋亡因子,下调Bcl-2等抑凋亡因子的蛋白和基因(P<0.01)。结果表明,枸杞外泌体可以抑制A549细胞增殖,促进A549细胞凋亡并且枸杞外泌体可通过线粒体通路诱导细胞凋亡。

宁夏地区162株大肠杆菌临床分离株对四环素类药物的耐药性分析

目的分析宁夏地区大肠杆菌临床分离株对四环素类药物的耐药性,为指导临床合理用药提供理论依据。方法采用PCR技术和药敏试验对宁夏地区临床分离的162株大肠杆菌进行四环素类药物耐药基因tetA、tetB、tetC、tetD、tetE和tetG的分子检测和耐药性研究。结果基因检测结果表明,在162株大肠杆菌临床分离株中,110株检测出了耐药基因,阳性率为67.9%。其中tetA基因的阳性率为40.1%,tetB基因的阳性率为29.6%。药敏试验结果表明,120株对四环素类药物耐药,耐药率为74.1%,耐药菌株中有15株未检测到tetA和tetB耐药基因。药敏试验结果与基因检测结果的符合率为87.5%;对四环素类药物耐药的87.5%大肠杆菌均携带tetA和tetB基因,其中7.5%的耐药菌株携带2种耐药基因。结论宁夏地区大肠杆菌临床分离株对四环素类药物具有较高的耐药性,应予以足够重视。

银北盐碱区植物根际土壤酶活性及微生物群落特征

开展盐碱区耐盐植物根际微生物群落多样性研究,对于盐碱土壤的植被恢复和生态修复具有重要意义。运用Biolog微平板技术,对宁夏银北盐碱区6种耐盐植物根际土壤酶活性及微生物群落代谢功能多样性进行研究。结果表明:不同植物根际土壤理化性质和酶活性存在一定的差异。与裸地相比,6种植物能显著提高盐碱地土壤酶活性,苜蓿根际土壤三种酶活性显著高于其他植物。土壤平均颜色变化率(AWCD)随培养时间的延长而逐渐增加,大小顺序依次为苜蓿(MX)、芨芨草(JJC)、柽柳(CL)、柳枝稷(LZJ)、苦豆子(KDZ)、枸杞(GQ)和裸地土壤(CK),根际土壤与盐碱裸地土壤之间差异显著(P<0.05)。土壤微生物群落香农指数、辛普森指数和麦金塔指数均以苜蓿根际土壤最高,芨芨草次之,二者较其他土壤差异显著(P<0.05)。不同植物根际土壤微生物碳源利用能力存在差异,苜蓿根际土壤微生物的利用率显著高于其他土壤(P<0.05),碳水化合物类是根际土壤微生物的主要碳源,其次为氨基酸类和羧酸类,胺类的利用率最小。主成分分析显示,对PC1和PC2起分异作用的主要碳源为碳水化合物类和羧酸类。综合各项指标,均表现为植物根际土壤优于盐碱裸地,其中苜蓿和芨芨草能显著提高土壤微生物群落功能多样性,对盐碱地根际微环境的养分循环具有积极意义。

石油污染土壤中的微生物群落结构与降解菌的分离

该文基于高通量技术,研究了石油污染对土壤的细菌和真菌群落结构的影响,采用选择培养基从石油污染土壤中分离石油降解菌并对其进行分子鉴定。结果表明,油污染土壤的微生物多样性减少,且优势菌群发生显著变化,油污染土壤中细菌和真菌在属水平上主要为Nakamurella、Pseudomonas、Proteiniphilum和Exophiala、Rhodotorula、Ochrocladosporium,这些微生物在石油烃类污染物的降解方面发挥了重要作用。以机油为唯一碳源从石油污染土壤中获得能利用机油作为碳源或能源的细菌11株,利用漆酶氧化丁香醛联氮产生的颜色变化筛选出具有较大降解石油潜力的菌株A01和A07,基于16S rRNA基因序列的分子鉴定表明,2菌株分别为不动杆菌和假单胞菌。

腹泻羔羊与健康羔羊肠道微生物群落分析

羔羊腹泻与其肠道菌群的种类及比例密切关系。为了探索肠道菌群结构在腹泻病程的变化,采集同样饲养条件下20份1月龄~3月龄滩寒杂交羊粪便样本,通过Miseq测序技术并结合多变量统计学方法检测细菌16SrRNA基因V4-V5区的多样性,通过数据分析,比较了腹泻羊粪便与正常羊粪便中微生物的类别及数量。从门的水平分析,腹泻羔羊肠道中变形菌门显著高于健康羔羊。发现拟杆菌门、蓝细菌门、黏胶球形菌门和无壁细菌门在腹泻羔羊中的含量显著低于健康羔羊。从科水平分析2个样本优势菌具有显著差异,其中腹泻羔羊肠道放线菌乳杆菌科显著高于健康羔羊,而瘤胃球菌科显著低于健康羔羊。非优势菌也存在显著差异,如拟杆菌科、柔膜菌科和理研菌科。比较了滩寒杂交羊健康羔羊及腹泻羔羊肠道微生物的差异,发现其微生物丰度及优势微生物都具有显著的差异,因此,腹泻羔羊中的肠道微生物差异可能是羔羊腹泻的重要因素之一,研究结果为羔羊腹泻的研究及治疗提供了理论依据。

宁杞7号枸杞根腐病发生的微生物学机制

从根表微生物群落结构及病原菌两个角度探究宁杞7号枸杞根腐病发生的微生物学机制。基于高通量测序分析微生物群落组成及多样性;采用组织分离法获取腐根真菌,结合形态学与分子生物学特征鉴定真菌的分类,依据柯赫法则进行致病性验证。患病株根表真菌群落结构已严重失衡,不仅丰富度和多样性显著低于健康株,而且优势类群的变化很大。患病株根表的优势属为镰刀菌属和粘帚霉属,相对丰度分别为38.81%和31.24%;而健康株根表的优势属为被孢霉属(14.09%)和镰刀菌属(10.38%),患病株根表潜在的病原菌丰度显著高于健康株。从腐根样品中共分离到33株真菌,分属于镰刀菌属、青霉属、俄氏孔菌属和粘帚霉属4个属,其中分离频率最高的是镰刀菌属,达到75.76%。镰刀菌属的2个种:腐皮镰刀菌(Fusarium solani)和尖孢镰刀菌(F. oxysporum)均可致宁杞7号枸杞患根腐病。本研究明确了宁杞7号枸杞根腐病的发生不仅与病原菌关系密切,而且与根表微生物的群落结构密切相关。

甜叶菊中9种甜菊醇糖苷积累与其生物合成关键基因表达量的相关性

为了研究甜叶菊中主要甜菊醇糖苷积累特点与其生物合成关键基因表达量的关系,本研究选取3个品种甜叶菊(普赛科3号、中山2号、同心)为试验材料,定期在幼苗期、营养生长期、花蕾期采收植株的上位3对叶片,采用液相色谱-质谱法(LC-MS)检测9种甜菊醇糖苷,即莱宝迪苷A、B、C、D、E、F(RA、RB、RC、RD、RE、RF)、甜菊糖苷(ST)、甜茶糖苷(RBS)和杜尔可苷A(DA)含量,同时利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析糖苷生物合成的3个UDP-糖基转移酶(UGTs)关键基因,即SrUGT91D2e、SrUGT74G1和SrUGT76G1的表达水平。结果表明,甜味糖苷RA在普塞科3号营养生长期含量最高(1.60 mg·g^(-1)),RD在普塞科3号的花蕾期含量最高(1.58 mg·g^(-1));苦味糖苷ST、RC、DA在普塞科3号中的积累量显著低于中山2号和同心(普塞科3号ST为0.50 mg·g^(-1)、RC为0.26 mg·g^(-1)、DA为0.01 mg·g^(-1)),因此普塞科3号可作为甜味糖苷高产选育品种。对甜菊醇糖苷生物合成关键基因表达量与糖苷含量进行相关性分析,甜味糖苷RD和RA的含量与其关键影响因子SrUGT91D2e和SrUGT76G1的表达量显著相关,苦味糖苷RC、ST、DA的含量与其关键影响因子SrUGT74G1的表达量显著相关。本试验为甜叶菊不同甜度糖苷的品种选育及采收时间的确定提供了依据。

弗氏链霉菌泰乐菌素还原酶基因编辑及其对泰乐菌素发酵产物的影响

目的对弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)泰乐菌素还原酶(tylosin reductase,SFR)进行改造以抑制其对泰乐菌素(tylosin)的还原作用,提高泰乐菌素发酵产量和产品质量。方法在前期对泰乐菌素还原酶编码基因第642位碱基进行定点突变形成终止密码子的基础上,对该基因642位后碱基进行敲除;对基因敲除菌株的生长以及发酵产物中泰乐菌素(A组分)和雷诺菌素(relomycin,D组分)含量进行分析。结果获得了泰乐菌素还原酶基因部分序列敲除的弗氏链霉菌菌株M1-d1;该菌株培养过程中生长状态及稳定期生物量与原始菌株基本一致,菌落形态正常;泰乐菌素发酵产物中敲除菌株A组分相对含量较原始菌株相比增加了10.08%,而D组分相对含量较原始菌株减少68.75%。结论弗氏链霉菌泰乐菌素还原酶基因部分序列敲除不影响菌体正常生长,但能够抑制泰乐菌素还原酶对A组分的还原作用,提高泰乐菌素发酵产物中A组分含量,显著降低D组分含量。

氨基酸代谢重编程在肿瘤发生发展中的作用

肿瘤的发生发展不仅取决于基因的突变或缺失,还随着肿瘤细胞的代谢重塑或异常改变而发生改变。在营养缺乏的条件下,肿瘤细胞的代谢重编程赋予癌细胞快速增殖的能力。其中,氨基酸代谢重编程是肿瘤代谢异常改变的重要特征之一。研究发现,氨基酸不仅能够作为氮供体为肿瘤细胞的增殖、侵袭和免疫逃逸过程提供核苷酸等生物大分子的合成原料,而且还是肿瘤微环境中免疫细胞活化和发挥抗肿瘤作用的重要代谢物质。氨基酸代谢的异常改变与肿瘤的发生发展和肿瘤免疫密切相关,其代谢途径中的部分关键蛋白质或关键酶可作为肿瘤诊断和治疗的生物标志物。因此,本文围绕氨基酸转运体对癌细胞增殖的影响和肿瘤代谢循环过程中的谷氨酰胺、天冬酰胺、丝氨酸和甘氨酸等氨基酸代谢的异常改变进行总结,介绍了氨基酸代谢与肿瘤细胞mTOR信号通路、肿瘤微环境和免疫细胞功能的相关性,对靶向氨基酸代谢的肿瘤治疗药物进行了分析和展望。期望该工作为深入了解氨基酸代谢对肿瘤发生发展的调控及其可能存在的肿瘤治疗靶点提供有用的参考。

外泌体miRNA及其在肺纤维化中的作用研究进展

外泌体是由细胞膜与多囊泡体融合并通过胞吐作用释放到胞外的纳米尺寸的脂双层囊泡,在细胞间通信作为媒介发挥重要作用。微RNA (microRNA, miRNA)是一类由18~24个核苷酸组成的内源性非编码RNA,在转录后基因表达中充当重要的调节因子。肺纤维化是一种不可逆、进行性的慢性肺部疾病,多项研究表明外泌体miRNA异常表达与肺纤维化发生发展息息相关。本文主要对外泌体及miRNA的生物学特性进行概述,讨论外泌体miRNA在肺纤维化疾病中展现出的重要作用以及其作为新型生物标志物在肺纤维化疾病中的巨大潜力。

发状念珠藻干旱胁迫响应基因NfGR的克隆与鉴定

该研究采用PCR技术,从发状念珠藻细胞中克隆了谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase,GR)基因,命名为NfGR,其开放阅读框长1 374bp,编码458个氨基酸,蛋白相对分子量为49.42kD,理论等电点为5.49。氨基酸序列分析表明,NfGR蛋白具有NADPH结合位点超家族(NADB-Rossmann superfamily)和吡啶氧化还原酶二聚体超家族(Pyr_redox_dim superfamily)2个结构域,与点形念珠藻(Nostoc punctiforme)的相似性达93%。系统进化树分析表明,NfGR与点形念珠藻处在同一进化枝上,亲缘关系较近。qRT-PCR表达分析表明,在不同浓度PEG-6000处理下,NfGR基因均保持上调表达,其中,PEG-6000浓度为8%时,NfGR基因的相对表达量达到峰值(32.69)。研究推测,谷胱甘肽还原酶可能参与了发状念珠藻对干旱胁迫过程的响应。

4种检测超广谱β-内酰胺酶方法的比较

以头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松和氨曲南为指示底物,用双纸片协同实验、纸片表型确证实验、三维实验和E-test法4种方法检测45株产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)阳性和59株产ESBLs阴性的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌.结果发现,4种方法的敏感性依次为95.56%,97.78%,93.33%,97.78%,特异性依次为96.61%,100.00%,98.31%,100.00%;头孢噻肟为宁夏地区用于检测ESBLs的最适指示底物;纸片表型确证实验和E-test法是4种检测方法中用于检测产ESBLs较可靠的方法,用三维实验检测产ESBLs菌株适合标本量较少的小型医院,双纸片协同实验和纸片表型确证实验在所有医院都适用.

元基因组文库分析技术研究进展

随着新的分析技术的不断出现和成熟,促进了微生物分子生态学及相关学科的诞生和迅速发展。其中,元基因组文库分析技术即是近年来微生物分子生态学研究领域兴起的一种新的分析技术。就元基因组分析技术诞生的背景及该技术的原理进行了讨论,着重阐述了元基因组文库分析技术在寻找新基因、开发新的生物活性物质、研究群落中微生物多样性、人类元基因组测序等方面的应用。另外,归纳总结了目前国际上常用的诸如PCR为基础的筛选、荧光原位杂交(fluorescent in situhy bridization,FISH)、底物诱导的基因表达筛选(substrate induced gene expression screening,SIGEX)、基因芯片等元基因组文库筛选方法,并就不同方法的优缺点进行了分析和讨论,指出了目前元基因组文库分析技术存在的主要问题并对今后该技术的发展进行了展望。

发状念珠藻醛酮还原酶基因NfAKR的克隆与表达

以发状念珠藻细胞为试材,采用PCR技术克隆了醛酮还原酶基因的开放阅读框(ORF)序列,命名为NfAKR。对基因序列特征进行了生物信息学分析,根据其编码氨基酸序列预测了NfAKR蛋白的三维结构,同时探讨了PEG-6000胁迫下NfAKR的表达特性。结果表明:NfAKR基因的编码序列长912bp,编码304个氨基酸,预测其编码蛋白的相对分子量为33.51kD,理论等电点为4.94,具有醛酮还原酶超家族保守结构域。NfAKR蛋白主要由10个α-螺旋和11β-折叠组成,中间形成一个疏水穴,作为酶的催化活性中心。NfAKR与点形念珠藻处在同一进化枝上,具有较近的亲缘关系。qRT-PCR分析显示,PEG-6000胁迫下NfAKR基因上调表达,当PEG-6000浓度为8%时,其相对表达量为5.66并达到峰值。依据NfAKR基因响应干旱胁迫上调表达的特性,推测醛酮还原酶可能参与发状念珠藻抵御干旱胁迫过程。

晶维他复合液体维生素对鸡理化性能的影响

本试验旨在研究复合维生素对鸡机体免疫能力、生长指标、新城疫抗体、血液生化指标、体尺性状的影响。试验选用1日龄鸡200只称重后随机分为5个处理组,每组40只,分别为A组(即42d全给药组)、B组(即隔天给药组)、C组(即前21d给药组)、D组(即后21d给药组)和对照E组(即42d全饮水组),试验周期为42d,E组自由饮水,A、B、C和D组在饮水中添加不同浓度的维生素。结果表明,B组、C组和D组鸡较A组、E组鸡的各项指标均有一定程度的提高,但是以B组效果较为明显,说明合理饲喂晶维他复合液体维生素可显著提高鸡的理化特性,但长期过量补充维生素会影响机体发育,降低机体的免疫力。

应用双重PCR技术快速鉴定结核与非结核分枝杆菌

本研究建立1种双重PCR技术,用于区分鉴定结核与非结核分枝杆菌。在最佳扩增反应条件下,检测引物P1、P2和P3、P4扩增结核分枝杆菌的特异性及敏感性,并对19株结核分枝杆菌和9株非结核分枝杆菌临床分离株进行扩增鉴定。结果表明,引物P1、P2能扩增所试13株结核和非结核分枝杆菌,P3、P4仅扩增结核分枝杆菌复合群菌种,两对引物同时扩增3种非分枝杆菌均为阴性。两对引物双重PCR检测结核分枝杆菌DNA的敏感性分别为100pg/μl和10pg/μl。检测28株临床分离株,结核分枝杆菌可扩增出368bp和225bp2条带,非结核分枝杆菌仅扩增出一条361bp～383bp带。因此,该双重PCR技术的建立为结核及非结核分枝杆菌的快速鉴定提供了1个可供选择的手段。

大肠杆菌耐热性肠毒素ST Ⅰ突变体与黏附素K99融合基因的构建及其表达

采用PCR技术从产肠毒素大肠杆菌C83922质粒中扩增出耐热性肠毒素(STⅠ)和黏附素K99基因片段,进一步结合基因重组技术成功构建了含有融合基因ST Ⅰ-Linker-K99的重组质粒pMSLK;通过PCR和寡核苷酸定点突变技术将STⅠ毒素中心的6个Cys分别突变成Ser和Gly,经亚克隆后将含有突变位点的融合基因插入到pET-20b表达载体中,获得了重组质粒pES(S)LK和pES(G)LK;将以上2种质粒分别导入到BL21(DE3)菌株中,成功构建BL21(DE3)(pES(S)LK)和BL21(DE3)(pES(G)LK)2种重组菌株,对其表达产物进行SDS-PAGE和免疫印迹分析。结果表明:这两种重组菌株都能高效表达ST Ⅰ突变体与K99的重组蛋白,而且表达的融合蛋白能够被产肠毒素性大肠杆菌强毒株C83922抗血清特异性识别。

产肠毒素性大肠杆菌疫苗研究概况

产肠毒素性大肠杆菌(简称ETEC)是引起仔猪腹泻的主要病原之一。在家畜中,尤以初生幼畜特别易感,并引起生长发育迟缓,生产能力低下,甚至造成死亡,给畜牧业造成很大损失。ETEC肠毒素基因和菌毛蛋白(黏附素)基因对于ETEC的致病性起主要作用。除了灭活疫苗、减毒疫苗、结合多糖疫苗和亚单位疫苗外,新近出现的DNA疫苗、转基因植物疫苗为疫苗的研制提供了新的思路。本文概述并评价了各类产肠毒素性大肠杆菌疫苗,并简要介绍了产肠毒素性大肠杆菌疫苗最新的进展。