抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体基因的克隆、表达及其生物学活性(英文)

应用RT PCR技术 ,从分泌具有中和活性的抗A型产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体 (McAb)的杂交瘤细胞株 1A8中 ,分别扩增出抗体VH 和VL 基因 ,用linker (Gly4Ser) 3 基因 ,将VH 和VL 基因连接成单链抗体 (ScFv)基因 ,并将其克隆至pGEM T载体中 .经核苷酸序列分析证实 ,VH 和VL 基因及linker基因拼接正确 ,ScFv 1A8基因全长为 72 6bp ,编码2 4 2个氨基酸 ,VH 和VL 基因符合功能性重排的鼠抗体可变区基因特征 ,分别属于鼠免疫球蛋白重链Ⅱ (A)和轻链κⅣ家簇 .将ScFv 1A8基因克隆至表达载体pHOG2 1中 ,构建了重组质粒pHOG 1A8,然后转化至受体菌XL1 BLUE中 ,得到重组菌株XL1 BLUE (pHOG 1A8) .ELISA检测和SDS PAGE分析表明 :经IPTG诱导后所表达的目的蛋白存在于重组菌株XL1 BLUE (pHOG 1A8)的胞周质中 .经薄层扫描分析 :重组菌株XL1 BLUE(pHOG 1A8)的蛋白表达产物占菌体可溶性蛋白的 1 2 % ,其相对分子量约为 31kD .ScFv的生物学活性研究表明 ,ScFv蛋白不但具有中和磷脂酶C的活性 。

表达大肠杆菌K88ac-ST_1-LT_B融合蛋白基因工程菌株的构建

利用PCR技术 ,从大肠杆菌C8390 2质粒中扩增出K88ac基因、ST1 突变基因和LTB 基因 ,通过分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化 ,构建了含K88ac ST1 LTB 融合基因表达载体的重组菌株BL2 1(DE3) (pXKST3LT5 )。经酶切鉴定和DNA序列分析证实 ,构建的重组质粒pXKST3LT5中含有K88ac ST1 LTB 融合基因 ,且基因序列和阅读框架均正确。经ELISA检测 ,重组菌株表达的K88ac ST1 LTB 融合蛋白能够被ST1 单抗、LTB 和K88ac抗体识别。经乳鼠灌胃试验证实 ,表达的融合蛋白已丧失天然ST1 肠毒素的活性。免疫实验结果表明 ,K88ac ST1 LTB 融合蛋白能够诱发小白鼠产生抗体 ,该抗体具有中和天然ST1 肠毒素的毒性作用 ,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪黄。

表达大肠杆菌K88ac-ST_1-LT_B融合蛋白工程菌株的免疫原性研究

已构建的能表达大肠杆菌K88ac_ST1_LTB 融合蛋白的工程菌株BL2 1 (DE3 ) (pXKST3LT5 )及其表达产物经动物试验证实没有毒性反应。用从IPTG诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原 ,免疫小鼠 ,结果免疫小鼠至少能抵抗 2MLD的大肠杆菌强毒株C83 90 2 (K88ac,ST+ ,LT+ )的攻击。用提取的包涵体免疫家兔后 ,采集的血清能够中和天然ST1的毒性。这表明构建的工程菌株BL2 1 (DE3 ) (pXKST3LT5 )可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的候选株。

大肠杆菌耐热性肠毒素(ST)的分子生物学研究进展

大肠杆菌的耐热性肠毒素 (ST)在产肠毒素性大肠杆菌引起的腹泻中扮演重要的角色 ,对人类和家畜的健康构成很大的威胁 .文章从ST的理化特性、致病机理等一般生物学特性到基因克隆、定点突变以及分子结构与功能的关系等分子生物学特征 ,全面概述了ST的分子生物学研究进展 ,对于从分子水平全面了解ST的结构、性质、致病机理以及免疫原性等生物学性状具有重要意义 .

植物生长延缓剂和修剪对多年生黑麦草干物质积累及净同化率的影响

随留茬高度增加 ,多年生黑麦草的相对生长速率和净同化率呈降低趋势。各延缓剂可显著降低多年生黑麦草的相对生长速率 。

大肠杆菌菌毛抗原K_(99)基因的亚克隆及核苷酸序列测定

利用PCR技术 ,从含有大肠杆菌菌毛抗原K99基因的质粒pX5K中扩增出 0 .4kb的K99菌毛抗原基因 ,然后将其亚克隆到pGEM T easy载体上 ,并转化至受体菌JM10 9中 ,采用碱性裂解法提取质粒DNA后 ,经NcoI和EcoRⅠ双酶切分析和核苷酸序列分析 。

植物生长延缓剂和修剪对多年生黑麦草主要生长特性的影响

与留茬 8cm和 4cm相比 ,留茬 6cm时多年生黑麦草株高净增量最小 ,密度最大。植物生长延缓剂可显著增加多年生黑麦草密度、降低株高、减少修剪次数。

产气荚膜梭菌β-毒素基因的克隆及CPB-ST融合基因的构建

用聚合酶链式反应 (PCR)技术 ,从B型产气荚膜梭菌染色体基因组中扩增了 930bp的 β -毒素基因。用限制性核酸内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ对PCR产物进行双酶切处理 ,然后 ,通过T4DNA连接酶将其定向连接于事先经同样的双酶切处理的载体质粒 pET - 2 8C(+)的多克隆位点 ,转化至受体菌BL2 1(DE3)中。经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切分析和PCR扩增检测。证明重组质粒 pECB2中含有产气荚膜梭菌的 β -毒素基因。经核苷酸序列分析 ,明确了克隆的 β -毒素基因在重组质粒中的连接向位和阅读框架是正确的。利用已构建的另一重组质粒pXST1(带有肠毒素性大肠杆菌的耐热性肠毒素ST基因 ) ,通过EcoRⅠ和SalⅠ双酶切处理 ,将切下的ST基因片段定向连接到 pECB2重组质粒中CPB基因的下游。经特定酶切分析鉴定 ,得到了理想重组子质粒pECB -ST1,CPB -ST融合基因在重组质粒 pECB

重组纤溶酶原激活剂及其突变体的表达研究

利用PCR技术 ,获得了人体组织型纤溶酶原激活剂tPAcDNA的缺失突变体———rPA ;在此基础上 ,运用定点突变技术 ,得到rPA的定点突变体———rPA(KHRR2 96～ 2 99AAAA) ,rPA(A473S)和二者的复合突变体rPA(KHRR2 96～2 99AAAA A473S) ;将rPA及其 3个突变体分别亚克隆至原核表达载体pET 2 8a(+)中 ,获得表达载体pErA ,pErA(K) ,pErA(A)和pErA(KA) .酶切鉴定和序列分析结果均表明实现了实验设计的氨基酸突变 .表达载体转化大肠杆菌 ,经IPTG诱导、菌体裂解及SDS PAGE电泳分析发现 ,只缺失而无突变的pErA和突变的pErA(A)都未表达目的蛋白 ,突变体pErA(K)与pErA(KA)则获高水平表达 ;蛋白产量分别占菌体总蛋白的 35 .97%与 37.71% ,分子量均为 39.6kD .Westernblotting显示 ,表达产物与抗tPA抗体呈特异性阳性反应 .该产物经初步纯化后进行复性与活性 (mFAPA)测定 ,结果表明其复性产物具有明显的体外纤溶活性 .以上结果为rPA突变体的进一步纯化。

不同培养条件对抗α毒素ScFv基因表达的影响

将ScFv基因片段与pHOG21载体连接后,转化至受体菌XL1-Blue中,得到重组菌株XL1-Blue（pHOG2E3）。随后研究了培养基中无机盐成分、温度、诱导时间、IPTG和蔗糖浓度对ScFv基因表达的影响。经SDS-PAGE分析表明,重组菌株XL1-Blue（pHOG2E3）在LB培养基中加入0.5mmol/L IPTG和 0.4 mol/L蔗糖,37℃诱导6h,其目的蛋白的表达量较高,表达的ScFv蛋白主要以包含体的形式存在,分子量为31,000D,在重组菌株的培养上清和菌体裂解上清液中,通过ELISA法也检测到了ScFv的存在,且具有中和α毒素的活性。

肾型鸡传染性支气管炎病毒X株S1基因序列的测定及同源性分析

根据国外已发表的鸡传染性支气管炎病毒 (IBV) S1基因序列 ,设计了 2对引物并以 RT- PCR特异性扩增出IBV X株的 S1基因 ,基因产物大小为 1.6 4kb,与设计相符 ,对其进行序列测定后 ,与标准毒株 H5 2、H12 0、M41、BEAU和澳大利亚 T株的 S1基因进行同源性比较。结果表明 ,X株与 H5 2、H12 0、M41、BEAU和澳大利亚 T株的核苷酸序列的同源性分别为 75 .8%、76 .1%、76 .3%、75 .5 %和 76 .9%,由此可以看出 ,IBV X株与标准毒株在 S1基因上存在较大差异。

内源淀粉特性比较研究

本文比较了不同内源淀粉粒大小、组成、结构特征的差异 ,分析了造成差异的生理及组成的分子基础 ,其结论为直链淀粉脂类复合物及蛋白质含量低 ,分子间氢键和共价键形成容易 ,淀粉粒大 ,溶胀能力强和支键淀粉含量高的淀粉 ,其淀粉糊胶粘度高溶液稳定性和增稠能力强 。

日本弓背蚁营养成分分析及其价值评价

对亚洲广布种日本弓背蚁 (Camponotusjamponicus)进行了营养成分分析 .结果显示 ,其体内含水量为 6 5 .47%±0 .5 3 % ,粗灰分为 6 .5 2 %± 0 .35 % ,总糖为 2 .37%± 0 .43% ,粗脂肪为 14.0 2 %± 0 .6 4% .在其 8种主要脂肪酸中 ,不饱和脂肪酸含量为 82 .45 5 % ,其中油酸C11 8为 5 1.884% ,棕榈油酸C11 6 为 11.30 2 % ,花生烯酸C12 0 为 6 .997% ,亚油酸C21 8为 8.881% ,亚麻酸C31 8为 3 .391% ,豆蔻酸C01 4 为 0 .86 1% ,软脂酸C01 6 为 12 .6 48% ,硬脂酸C01 8为 4.0 37% .由此认为 ,日本弓背蚁是一种不逊色于双齿多刺蚁的食物资源 .

AGPase及其基因表达研究

ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)是淀粉生物合成的限速酶,本文讨论了到目前为止对不同植物AGPase基因及其表达的研究结果。其中包括AG-Pase大小亚基编码基因表达的分布及调控。其结论为:完整AGPase两个大亚基和两个小亚基对合成正常含量的淀粉缺一不可;有多个等位基因编码植物AGPase大小亚基,它们表现发育阶段、组织器官、细胞质体内外及诱导条件的分化表达;尽管各亚基表达于含淀粉的组织,但它们在储藏组织内的表达量远高于其他组织;对调控不敏感的外源AGPase基因导入淀粉植物将会成为提高淀粉含量的重要途径。提出了进一步研究中存在的问题及可能的解决途径。

嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒W93疫苗株S1基因的克隆与序列测定

根据国外已发表的鸡传染性支气管炎病毒 (IBV)S1基因序列 ,设计了两对引物并以RT_PCR特异性扩增出嗜肾型IBVW93疫苗株的S1基因 ,基因产物大小为 1.6 2kb ,与设计相符 ,对其进行序列测定后 ,与标准毒株H5 2、H12 0、M41、BEAU株的S1基因进行同源性比较 ,结果表明 ,W93株与H5 2、H12 0、M41和BEAU株的核苷酸序列的同源性分别为 96 .8%、97.1%、96 .9%和 96 .8% 。

植物生长延缓剂和修剪对多年生黑麦草抗旱性的影响

对植物生长延缓剂和修剪处理下多年生黑麦草的抗旱性进行研究。结果表明:在干旱胁迫的各个阶段,留茬6cm处理叶片含水量和游离脯氨酸含量显著高于其他处理。各延缓剂处理下的叶片含水量和游离脯氨酸含量均高于对照,可显著增强多年生黑麦草的抗旱性。