HPS OmpP2膜外结构环诱导PAMs IL-8 mRNA转录的研究

OmpP2是副猪嗜血杆菌的致病因子,也是其重要的免疫原性蛋白。为探明OmpP2蛋白8个膜外结构环(Loop)在HPS感染过程中的促炎作用,本试验以猪肺泡巨噬细胞(Porcine Alveolar Macrophages,PAMs)为细胞模型,以HPS血清5型标准菌株OmpP2蛋白、HPS血清5型标准菌株全菌体及牛血清白蛋白(BSA)作为参照,通过Real-Time PCR的方法研究OmpP2 8个膜外结构环诱导PAMs产生炎性应答的作用。结果显示,与空白对照组相比,HPS血清5型标准菌株OmpP2蛋白膜外结构环均能诱导PAMs细胞使其促炎细胞因子IL-8的转录水平出现不同程度的上调,表明它们在HPS感染过程中参与了宿主肺泡巨噬细胞的促炎性免疫应答;在8个膜外结构环中,Loop7(2^(-△△Ct)≈8,P<0.05)表现出非常显著的刺激活性,远远高于其他膜外结构环组,并与HPS血清5型标准菌株OmpP2蛋白组的诱导上调幅度(2^(-△△Ct)≈12(P<0.05))最接近,表明Loop7在OmpP2蛋白诱导PAMsIL-8促炎性免疫应答过程中扮演着重要角色,结果暗示Loop7很可能是OmpP2致宿主肺巨噬细胞促炎性功能活跃区。本试验为进一步了解OmpP2蛋白功能及了解HPS诱导宿主细胞炎症反应分子机制提供实验基础。

副猪嗜血杆菌外膜蛋白P2的提取及鉴定

为简化副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)外膜蛋白中的单一蛋白外膜蛋白P2(OmpP2)的分离步骤,降低膜蛋白分离的设备要求,本试验用Hps标准3型(SW114)、5型(Nagasaki)菌株作为试验材料,选用溶菌酶、核酸酶对Hps进行酶解以获得其完整外膜,然后利用含有2%tritonX-100缓冲液对外膜进行进一步解离,最后利用适量浓度的胰酶对强疏水蛋白进行酶解,实现了Hps高纯度OmpP2的体外快速提取。SDS-PAGE结果显示,上述2株菌OmpP2大小分别约为43和38ku;基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF)鉴定结果显示,从上述蛋白酶解下来的肽段经比对与Hps的OmpP2完全吻合。斑点杂交(Dot-blot)显示采自Hps患病猪血清在点有5型菌株(Nagasaki)OmpP2和点有3型菌株(SW114)OmpP2NC膜上均发生杂交显色反应,该结果暗示OmpP2是一个具有免疫活性的抗原。本研究为OmpP2功能及免疫保护性研究奠定了基础,也为副猪嗜血杆菌病免疫学诊断提供新的参考。