宁波大学海洋学院海洋生物技术研究团队简介

宁波大学海洋学院海洋生物技术研究团队成立于2007年，目前有教授3人，副教授4人，具有博士学位研究人员9人。主要研究方向包括海洋生物基因资源和活性物质的研究与开发，主要研究领域涉及动物行为学、病理学、分子免疫学和海洋药物学等。团队先后主持国家及省部级科研项目20余项，得到国家973前期专项、国家863计划、国家自然科学基金、

生物技术清洁生产替代高污染化学法制备甲壳素的研究与应用

从虾壳中分离到一株乳杆菌BR-3,研究发现其最佳发酵起始pH为6.50,最佳培养温度为35℃,在此培养温度下达到对数生长期的时间为42h。采用乳杆菌发酵方法,进行了虾壳制备甲壳素的研究,比较了接种量、葡萄糖加入量、发酵时间等因素对产品质量的影响。结果表明,当接种量为10%、葡萄糖浓度为4.5%、固液比为1︰3、发酵温度为(35±2)℃、发酵时间为3—4d时,平均灰分去除率达95.67%,甲壳素产品灰分含量均小于6%,最低可达1%,产品质量等于或优于传统的酸碱生产方法。发酵液可部分或全部回收,洗涤废水可作下一轮发酵用水,生产废水接近零排放。虾壳乳酸发酵法生产甲壳素是一种清洁生产方法。BR-3培养时间短,培养条件粗放,温度和pH适应范围宽,产酸效率高,残糖少,适合于工业化生产。

海洋生物共栖细菌抑藻活性的初步研究

针对我国常见赤潮藻种赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo)及海洋原甲藻(Prorocentrum micans),通过细胞活体荧光测定方法,研究了15株海洋生物共栖细菌对微藻生长的抑制作用,同时,对它们进行了分子生物学鉴定,分析了其系统发生学关系。结果表明,7株细菌的代谢产物对2种微藻的生长具有不同程度的抑制作用,并表现出一定的选择性,其中3株海洋细菌NJ6-3-2,QD1-2,ATCI02-4的代谢产物对2种赤潮微藻的生长都具有抑制作用。系统发生学分析显示,具有抑藻活性的海洋细菌中有4株(NJ6-3-1,QD1-2,SSN-6,SS6-4)属于-γproteobac-teria分支,另外3株(NJ5-7-1,NJ6-3-2,ATCI02-4)属于Gram+细菌。

PCR-SSCP技术在微生物群落多态性分析中的应用进展

PCR-SSCP技术是新近发展起来的一种分子生物学分析技术,因具有快速、简便、灵敏和适于大样本筛查的特点,能有效检出碱基置换、缺失、插入等基因变异,因而有广泛和潜在的应用价值。该文较系统地介绍了PCR-SSCP方法的发展过程、技术优势及其在环境生态、食品微生物等领域中微生物群落多态性检测的应用进展,并对其发展前景作了展望。

固定化微生物在凡纳滨对虾养成池中的应用

通过监测池塘水体藻类群落组成、多项水质指标、底泥总有机碳(TOC)和底泥异养细菌数等指标值,研究了固定化微生物对凡纳滨对虾生产性养殖池塘水质调控和污染底泥的修复能力,微生物固定所用载体为改良沸石和生物活性炭(相应的固定化微生物分别记为ZE-M组和BE-M组)。试验结果显示,处理组(ZE-M组和BE-M组)池塘水体中藻类组成呈多元化,隐藻、蓝藻和绿藻数量比较接近,而对照组则是蓝藻占绝对优势。试验过程中,对照池的氨氮浓度和COD呈直线上升,而处理组氨氮浓度和COD的增长幅度缓慢,ZE-M、BC-M载体微生物的使用是产生差异的直接原因。对照组和处理组的其它水质指标变化规律及差异性不明显,可能是由于池塘水体由诸多不确定因素影响所致。固定化微生物对池塘底泥TOC含量和异养细菌数的影响显著(P<0.05),试验过程中,试验组和对照组池塘底泥TOC含量随着养殖时间均有增加的趋势,但对照组这一趋势更加明显;试验初期,各组表层底泥中的异养细菌数量在3.367×105～8.60×105CFU/g范围内,试验结束时增长到85×105～393.7×105CFU/g。处理组和对照组的异养细菌差异显著(P<0.05),其中ZE-M处理组最低,仅为对照组的21.59%。试验结果表明,凡纳滨对虾生产性养殖池塘中应用固定化微生物技术能显著改善池塘水质、稳定水体藻相结构和提高微生物对污染底质的生物修复能力。

海洋微藻中C3羟基甾醇TMS衍生物EI源质谱规律研究

通过推测甾醇TMS衍生物特殊碎片的质谱裂解规律,结合标准品TMS衍生物的质谱图进行分析。根据质谱特征离子确定甾核的双键数,甲基化程度和侧链上双键数,烷基化程度以及相关的位置。用Bligh-Dyer法提取总脂,V(氯仿)∶V(正己烷)=1∶4的混合溶液提取甾醇,BSTFA衍生化,进行气相色谱-质谱分析。应用此研究规律对4种甲藻:共生藻属甲藻(Symbodiniumsp.)、锥状斯克里普藻(Scrippsiella troch-oidea)、海洋原甲藻(Prorocentrum micans)、无纹环沟藻(Gyrodinium instriatum)的甾醇组成进行鉴定。

海洋交替假单胞菌QD1-2抗肿瘤活性辅酶Q衍生物的分离与结构鉴定

海洋交替假单胞菌(Pseudoalteromonas rubra QD1-2)是从青岛海域分离筛选出的一株具有抗肿瘤活性的菌株。为了明确海洋交替假单胞菌(Pseudoalteromonas rubra QD1-2)的抗肿瘤活性成分和结构,利用大孔树脂柱层析、半制备HPLC等分离方法,首次从菌株QD1-2发酵液中分离到了一个单体化合物。通过高分辨率质谱、一维和二维核磁共振波谱等现代波谱技术进行结构鉴定,经测定,分子量为320,分子式为C18H24O5,为辅酶Q2衍生物。最后利用MTT法进行抗肿瘤活性测试,显示了较强的抗肿瘤活性。这一结果揭示了海洋交替假单胞菌产生新颖抗肿瘤化合物巨大的潜力,该属为寻找新型抗肿瘤天然化合物提供了新的来源。

富营养水体中2种水生植物的根际微生物群落特征

选取宁波市城区内河2个营养类型水体日湖(中-富营养类型)和卧彩江(重富营养类型),于2008年8～11月,利用MIDI Sherlock MIS系统和其他传统方法,跟踪监测了2个水体内2种常见水生净化植物粉绿狐尾藻(Myriophyllum aquaticum)、喜旱莲子草(Alternanthera philoxeroides)根际微生物的种类、数量及其季节变化,分析了水体主要水质参数、水体微生物与植物根际微生物之间的相关性.结果表明,水生植物根际效应显著,不同月份植物根际微生物数量均要显著高于水体环境;植物种类对植物根际微生物影响显著,在日湖水体,狐尾藻根际微生物数量要显著高于喜旱莲子草;在卧彩江,2种植物根际细菌数量无显著差异,放线菌、真菌数量差异显著,植物根际微生物数量与水体环境因子之间具有一定的相关性,调查期间,日湖水温、TN、TP、Chla与植物根际微生物数量间均无显著相关,仅COD与喜旱莲子草根际细菌数量显著负相关;在卧彩江,TP与粉绿狐尾藻、喜旱莲子草根际放线菌数量显著负相关,其余水质参数与根际微生物数量均无显著相关.植物根际优势菌种以假单胞菌属(Pseudomonas)、微球菌属(Micrococcus)、黄杆菌属(Chryseobacterium)、不动杆菌属(Acinetobacter)等有机物降解微生物为主,环境因素的变化和植物种类的不同也导致了葡萄球菌属(Staphylococcus),食酸菌属(Acidovorax)、节杆菌属(Arthrobacter)等特有菌种的出现.对植物根际微生物群落结构进行聚类分析表明,除日湖喜旱莲子草根际微生物群落结构在夏、秋两个季节相似性较高外,其余几个处理的根际微生物群落结构相似性在21.60%～51.57%.日湖植物根际微生物多样性夏季高于秋季,而卧彩江中夏季低于秋季;日湖中2种植物之间无论夏秋均无显著差异,而在卧彩江,夏季喜旱莲子草要显著高于粉绿狐尾藻,秋季则完全相反,据此说明植物根际微生物多样性受水体富营养化程度和植物种类等多重因素的影响.

湖南镇水库浮游生物及其影响因子的典范对应分析

2006年至2007年间调查了蓝藻(Cyanophyta)暴发水体——湖南镇水库的浮游生物群落结构及其变化,研究了其与环境参数之间的关系。调查期间,共鉴定出浮游植物96种(属),浮游动物73种(属)。单位水体浮游植物平均细胞数量变化于0.49×106～16.71×106L-1之间,浮游动物则变化于8～3548L-1之间。春、夏季螺旋鱼腥藻(Anabaena sporoides)水华持续数月,水体表层细胞密度高达2.28×108L-1,进入秋季后其优势逐渐被颤藻属(Oscillatoria)蓝藻取代。典范对应分析显示,浮游植物的季节演替规律与螺旋鱼腥藻数量、总溶解固形物(TDS)和透明度(SD)存在较高的相关性,浮游动物演替主要与溶解在水中的微囊藻(Microcystis)毒素(EMC)、营养盐和螺旋鱼腥藻数量相关。由于高水平营养盐的存在,上行效应无法有效限制蓝藻的发生,水华蓝藻以其数量优势改变了水体理化条件,成为影响浮游植物群落的潜在因素,而营养盐可能通过主导可食藻类的生长,间接影响浮游动物的动态。将水华蓝藻数量及藻毒素浓度作为环境因子进行多元分析,分别提高了对浮游植物、动物群落的解释15.6%和25.8%,说明水华蓝藻和藻毒素的存在对浮游生物群落的组成和结构具有较大的影响。

浒苔中生物活性物质的研究进展

浒苔（Enteromorpha）属于绿藻门（Chlorophyta）、石莼目（Ulvales）、石莼科（Ulvaceae），是一类广温、广盐、耐干性的大型海藻，常生长在高、中、低潮带砂砾、岩礁和石沼中。在世界范围内分布于俄罗斯远东海岸、日本群岛、马来群岛和欧洲沿岸等海域。在中国各海区均有分布，属黄海、东海海域优势种。

根际微生物在污染水体植物修复中的作用

综述了近年来国内外有关水生植物根际微生物在污染水体和湿地修复中的作用研究成果,深入探讨了植物修复的机理。指出水生植物对污染环境的修复主要依赖环境、水生植物和微生物以及三者之间的联合作用,植物和微生物的耦合作用是水生植物应用于水体修复的重要机制。人工湿地对氮的去除主要通过微生物的硝化-反硝化作用途径;根际微生物和植物的联合作用可以改变磷的存在形态,从而加速磷的去除;在有机物和重金属污染环境中,根际微生物通过增强植物对环境的适应性促进污染物的去除。

SSCP方法的条件优化与榨菜低盐腌制微生物多样性分析

应用单链构象多态性(SSCP)方法研究榨菜低盐腌制条件下的微生物群落结构与变化。研究了凝胶质量浓度、电泳前处理、银染操作条件对SSCP分析方法的影响。结果表明,在凝胶质量浓度为22 g/dL、丙烯酰胺与双丙烯酰胺质量比为29∶1,并加入体积分数6%的甘油,4℃条件下1×TBE缓冲液中250 V电泳18 h,通过强碱性显影液和甲醛作还原剂的银染方法显色,可以获得理想的SSCP图谱。对榨菜低盐腌制不同时期样品的SSCP图谱分析结果,发现在榨菜腌制初期优势菌群为肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides),随后转变为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和短乳杆菌(Lactobacillus brevis)占优势;腌制后期主要存在的优势菌群为植物乳杆菌和Lactobacillus versmoldensis,结合感官分析证实这些优势乳酸菌对保持制品高品质具有功能作用。

固定化微生物修复养殖池塘污染底泥的围隔试验

通过测定上覆水的多项水质指标、底泥总有机碳(TOC)、底泥生物降解能力(G值)、底泥异养细菌数和反硫化细菌数等指标值,在野外实验围隔条件下比较了固定化微生物和游离微生物(FR-M)对污染底质的生物修复能力。微生物固定所用载体包括:纤维网状活性炭,生物活性炭,沸石和硅藻土(相应的固定化微生物分别标记为FC-M,BC-M,ZE-M和D I-M组)。结果显示:固定化微生物对围隔内水质有间接影响,试验后期固定化微生物组(ZE-M,D I-M和FC-M组)的上覆水硝氮浓度显著高于对照组(P<0.05);BC-M组和ZE-M组上覆水中的COD值显著低于游离微生物组(FR-M)和对照组(P<0.05),说明固定化微生物有效削减了水底界面还原性物质的污染程度;与游离微生物或对照组相比,固定化微生物组(FC-M组,D I-M组和ZE-M组)能更有效地降解底泥有机质。固定化微生物对底泥生物降解能力(G值)的影响明显,实验后期固定化微生物组((BC-M组,D I-M组和ZE-M组)的G值均显著高于对照组和游离微生物组(P<0.05),说明固定化微生物技术的运用显著提高了围隔底泥的生物降解能力;固定化微生物对围隔内底泥异养细菌总数影响不显著(P>0.05),可能是由于底泥微生物群落结构受其它多种因子的综合影响所致。固定化微生物对底泥反硫化细菌影响显著(P<0.05),与对照组和游离微生物组相比,固定化微生物(尤其是ZE-M和BC-M组)能更有效地减少围隔底泥反硫化细菌数。实验结果表明,利用载体固定微生物技术能显著提高微生物对污染底质的生物修复能力,其中以ZE-M和BC-M组效果最好。

生物强化反应器净化循环养殖废水的研究

利用生物膜的高效截留原理,设计了生物强化反应器,在装有弹性纤维载体的反应器内接种具有硝化反硝化作用的复合菌群,经6周左右的人工挂膜后,弹性纤维载体表面出现了肉眼可见的生物膜。试验以循环养殖废水为研究对象,探讨了不同水力停留时间(HRT)和温度(WT)对生物强化反应器净化水质效果的影响。结果显示,HRT和WT对生物强化反应器净化养殖废水效果的影响显著(P<0.05)。对HRT和WT各处理水平下的CODMn、TN和NH4+-N去除率进行差异显著性分析,并综合考虑反应器的运行时间、费用和操作等因素,选取HRT=18 h、WT=30℃作为反应器的最佳运行条件,在此条件下反应器稳定运行3周左右。试验期间,CODMn、TN及NH4+-N的平均去除率分别达44.18%、51.31%及82.08%。此外,还对反应器内载体表面的生物膜进行了可培养微生物数量动态监测。强化反应器在正式运行的25 d内,其生物膜上的可培养微生物数量不断增多,氨氧化细菌数量由35.91×104 CFU/mg增长到89.43×104 CFU/mg,硝化细菌数量由25.75×104 CFU/mg增长到61.65×104 CFU/mg,反硝化细菌数量由14.23×104 CFU/mg增长到100.95×104 CFU/mg;氨氧化细菌和硝化细菌在与氮素循环相关的可培养细菌中占据着主导地位(59.95%～81.25%)。脱氮细菌不断地吸附于载体表面,并成功地定殖和繁殖使得生物膜不断成熟和稳定(TN和NH4+-N去除率分别达51.31%及82.08%)。结果表明,生物强化反应器对循环养殖废水中CODMn、TN和NH 4+-N的去除效果明显。

鱼类致病鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)的LAMP检测技术建立与应用

针对鰤鱼诺卡氏菌16S—23SrRNA基因内转录间隔序列,设计了四条LAMP引物,在外内引物浓度比1:8、dNTP浓度0.8—1.2mmol/L、Mg2+浓度10—14mmol/L、反应温度60—65℃、反应时间60min的优化条件下,扩增产物经电泳后呈现特异性的LAMP梯形条带,建立的LAMP法具有高灵敏度,达到10-7μg/μlDNA浓度,比常规PCR方法高100倍。将该方法应用于取自养殖场的乌鳢、大黄鱼、黄姑鱼组织样品检测,结果在16份组织样品中有7份检出自然感染的鰤鱼诺卡氏菌,与同步取样品鱼组织的细菌分离、培养检查结果相一致,并显示既能检测发病鱼,又能检出未发病且已感染的病鱼。分析表明,这是一种能快速、简易、特异、敏感的检测鱼类致病鰤鱼诺卡氏菌的诊断方法。

养殖大黄鱼病原弧菌多重PCR检测技术的建立和应用

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是浙江省养殖大黄鱼(Pseudnosciaena crocea)弧菌病的主要致病菌。本研究选择针对溶藻弧菌和副溶血弧菌的胶原酶基因,哈维氏弧菌的部分ToxR基因的特异性,优化设计了3对特异性引物,通过进行多重PCR反应体系优化,多重PCR产物的测序鉴定与特异性和敏感性实验,建立了一种检测致病性弧菌的多重PCR检测方法。经过琼脂糖凝胶电泳后的条带分析判断,可以在一个PCR管中同时成功地检测这3种病原细菌,含溶藻弧菌、哈维氏弧菌和副溶血弧菌3种致病弧菌核酸的阳性对照样品分别扩增出大小为737bp、382bp和271bp的预期产物,其灵敏度是102～103CFU/mL。将该方法应用于检测人工感染后的养殖大黄鱼病鱼肝脏和肾脏,结果在6份组织样本中,5份检出原始感染菌株,与API20E鉴定结果相符;对弧菌病流行季节采集的未发病的16份养殖大黄鱼组织样本和16份水体样本进行抽检,结果在1份大黄鱼组织样本中检出哈维氏弧菌,7份水体样本中检出这3种弧菌中的1种或2种,鉴定结果与API20E鉴定结果符合率为93.75%。说明该方法不仅可以检测发病鱼,还可以检测无病症带菌大黄鱼以及带菌水样,且说明海洋水体中存在着大黄鱼弧菌病的致病菌。结果说明,多重PCR检测方法具有较高的敏感性与特异性,可以缩短检测时间,降低检测成本,该方法的建立对养殖大黄鱼弧菌病的快速诊断和分子流行病学的调查具有重要意义。

不同模式凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)养殖池塘沉积物酶活性及其微生物群落结构分析

采用现场测定、磷脂脂肪酸(PLFA)法及基质脱氢酶活性测定等方法,对4种不同养殖模式的凡纳滨对虾池塘的水质、沉积物酶活性及微生物群落结构进行了分析和研究。结果表明:养殖末期,凡纳滨对虾淡水混养和海水混养池塘水质较好,海水集约化池塘水质最差;其中海水集约化池塘沉积物基质中有机质含量、微生物生物量、微生物活性和酶活性都很高,真菌、G+菌的相对含量则很低。主成分分析(PCA)表明:第一主成分主要与脲酶、有机质含量、微生物活性、总PLFA、B/F有显著的正相关关系(r>0.9),而与Gram+/Gram-、pH、18:1ω9C/T、单不饱和/支链却存在显著的负相关关系(r>0.9);第二主成分主要与脱氢酶有显著正相关关系(r>0.8),四种池塘在PCA图中分散开,说明其微生物群落结构及环境状况存在明显差异。

日本真海带对硒的积累和生物转化

在海水中添加亚硒酸盐（Na2SeO3）及不同浓度的氮磷营养盐（NaNO3＋NaH2PO4），研究海带对硒的积累，通过分离测定海带富硒前后各生化组分的含硒量来探讨硒的生物转化问题．结果表明天然海带含硒量（鲜重）为0．451～0．596μg／g，海带富硒最佳的Na2SeO3浓度为200mg／dm^3，培养56h后的富硒倍率约为50．在天然海带中，硒主要以有机态存在，有机硒占总硒含量的86．22％；在含有200mg／dm^3 Na2SeO3的海水中培养56h后测得海带的总硒为24．481μg／g，其中有机硒含量为16．703μg／g，无机硒为4．714μg／g；在添加氮磷营养盐的含硒海水中，海带的富硒能力得到进一步的提高，在适宜的氮磷条件下（150mg／dm^3 NaNO3和25mg／dm^3 NaH2PO4）总硒含量达到33．649μg／g，而无机硒含量基本不变，为4．497μg／g，因此提高部分转化为有机硒，有机硒含量达到24．678μg／g．这说明海带具有通过自身代谢将无机硒转化为有机硒的较强的能力．

甾醇TMS衍生物EI源质谱规律研究

The mass spectrometric fragmentation of TMS derivatives of sterols was studied and analyzed based on the mass spectrometry of the TMS derivatives of standards.The double bond numbers and the degree of the methylize,alkylize and the related position in the sterol nucleus and the side chains were confirmed by the characteristic ions.Total lipids were extracted using Bligh-Dyer method.Sterols were isolated by solvent partition with chloroform-hexane(1 ∶4,by volume),derivated by BSTFA,and analyzed by GC-MS.The regular pattern was used for identifying the sterols in a dinoflagellate from the Symbodinium sp.

底泥微生物活性对蓝藻水华水柱及沉积物间隙水氮磷分布的影响

比较研究了蓝藻水华暴发水体与无蓝藻水华暴发水体的沉积物间隙水NH_4^+-N、NO_3^--N和。PO_4^(3-)-P的垂向分布特征和表层沉积物的微生物活性(FDA)、碱性磷酸酶活性(APA),并对它们的相互关系进行了统计分析。结果表明,NH_4^+-N含量在两类水体中,都呈现出表层水<底层水<间隙水的趋势,表明其有从沉积物向上覆水体扩散的风险;而PO_4^(3-)-P、NO_3^+-N浓度则呈现表层水>底层水>间隙水的趋势;沉积物有机质(LOI)、APA和FDA活性也都随着深度增加而逐渐降低。APA与FDA活性之间相关性极显著,暗示碱性磷酸酶的分泌主要受微生物活性的影响。间隙水NH_4^+-N含量与表层10 cm内底泥的APA和FDA活性具有极显著正相关性(a=0.01),表明在厌氧环境中,微生物对氮素的分解和矿化作用主要受二者活性影响。