和厚朴酚通过Hippo-YAP信号通路影响鼻咽癌CNE1细胞周期与凋亡

目的:探究和厚朴酚对CNE1鼻咽癌细胞周期和凋亡的影响及分子机制。方法:采用不同浓度的和厚朴酚处理CNE1细胞,噻唑蓝(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)法测定细胞的活性;将CNE1细胞分为空白对照组,10、20、40 μmol/L和厚朴酚处理组和10 μg/ml顺铂组。流式细胞术检测细胞周期分布,线粒体膜电位检测试剂盒检测细胞线粒体膜电位,原位末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)法检测细胞凋亡,免疫印迹检测细胞中增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)和细胞周期蛋白D1(G 1/S specific cyclin D1,cyclin D1)蛋白表达;体外培养CNE1细胞,和厚朴酚处理后进行转录组测序,实时荧光定量反转录聚合酶链反应(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测Yes激酶相关蛋白(yes-associated protein delta,YAP)mRNA表达,免疫印迹检测磷酸化YAP蛋白(phospho-YAP,p-YAP)以及细胞核中YAP蛋白表达水平,免疫荧光检测YAP蛋白核分布;将细胞分为对照组、哺乳动物STE20样激酶1/2(mammalian STE20-like kinase 1/2 inhibitor,MST1/2)抑制剂(XMU-MP-1)组、和厚朴酚组、XMU-MP-1+和厚朴酚组,利用免疫印迹、流式细胞术和TUNEL法观察Hippo通路在和厚朴酚影响CNE1细胞周期与凋亡中的作用。采用GraphPad Prism 8.0软件对数据进行统计学分析。 结果:与对照组比较,和厚朴酚处理组CNE1细胞活力、线粒体膜电位、PCNA与cyclin D1蛋白表达水平显著降低( P值均<0.05),G 0/G 1期细胞比例和TUNEL阳性细胞率显著增加( P值均<0.05)。转录组分析结果发现,差异基因主要富集在Wnt信号通路、肿瘤坏死因子通路和Hippo信号通路等。和厚朴酚处理后,细胞中YAP mRNA表达和细胞核中YAP蛋白表达水平降低,p-YAP蛋白水平升高,较对照组差异有统计学意义( P值均<0.05)。与和厚朴酚组比较,XMU-MP-1+和厚朴酚组细胞中的p-YAP蛋白表达水平降低(1.157±0.076比0.479±0.038, t=37.120, P<0.05),细胞核中YAP的蛋白表达水平升高(0.143±0.012比0.425±0.031, t=29.181, P<0.05),G 0/G 1期细胞比例降低[(72.494±3.309)%比(58.747±2.865)%, t=17.265, P<0.05]、细胞凋亡水平减少[(53.158±3.376)%比(29.621±2.713)%, t=28.584, P<0.05]。 结论:和厚朴酚能够引起CNE1鼻咽癌细胞周期阻滞,诱导细胞凋亡,这可能是通过调控Hippo/YAP信号通路来实现的。