清咽口服液清咽功能的实验研究

目的:考察清咽口服液的清咽作用。方法:大、小鼠每日分别经口给予不同剂量的清咽口服液,阴性对照组给予等量蒸馏水。连续灌胃30d后,进行大鼠棉球植入实验、大鼠足趾肿胀实验、小鼠耳肿胀实验。结果:与阴性对照组比较,清咽口服液高剂量组大鼠肉芽肿净量、1h组织肿胀率、小鼠耳肿胀率均明显降低(P<0.05)。结论:动物实验结果表明清咽口服液具有清咽效果。

毛茛中与苯丙烷生物合成途径相关的1R-MYB类转录因子的鉴定与分析

1R-MYB家族在植物生长发育、抗胁迫、次生代谢物合成中具有重要的调控作用。本研究基于毛茛(Ranunculus japonicus Thunb.)的全长转录组测序数据库,分析了其1R-MYB家族成员的基序、系统进化关系、表达特性、空间结构及功能。结果共鉴定出221个1R-MYB基因,其中18个通过KEGG富集到苯丙烷生物合成途径,可能调控此途径中的过氧化物酶。研究结果为深入探究毛茛1R-MYB转录因子调控苯丙烷的生物合成机制奠定了基础。

异叶天南星苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与蛋白结构分析

以异叶天南星(Arisaema heterophyllum Blume)为材料,采用逆转录PCR(RT-PCR)法扩增其苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase,PAL)基因Ah PAL,获得该基因的开放读码框(ORF),并通过系统的生物信息学软件分析Ah PAL的结构和理化性质。结果显示,Ah PAL的ORF全长为2184 bp,编码727个氨基酸;Ah PAL与郁金香(Tulipa fosteriana W. Irving) PAL的亲缘关系最近,序列相似性达88%。空间结构模型分析结果显示,Ah PAL为同型四聚体,每个单体由3个结构域组成,其中MIO结构域含有PAL酶家族的保守序列和Ala-Ser-Gly三肽活性中心,是Ah PAL酶活性的决定性结构域。利用荧光定量PCR方法检测3个Ah PAL Unigene在根、块茎和叶中的表达情况,发现它们在根中表达量均最高,而在叶和块茎中表达较低。

基于转录组测序的细风轮花青素合成途径及关键酶基因分析

为进一步理解细风轮花青素合成途径,本研究利用华大基因BGISEQ-500平台对细风轮中的根、茎、叶、花4个组织进行了转录组测序,从头组装后得到128856个Unigene。KEGG通路表明有40个Unigene编码了细风轮的花青素生物合成途径中6个关键酶。我们对其中的关键酶DFR(二氢黄酮醇还原酶)进行同源比对和空间结构模拟,结果显示DFR序列和结构均具有良好的保守性,且具有高度保守的NAD+结合位点,其二级结构主要由α螺旋和β折叠组成,在空间上α螺旋包裹着β折叠,形成“夹心饼干”样结构。

三叶木通转录组分析及三萜皂苷生物合成途径关键酶基因的发掘

为了解三叶木通(Akebia trifoliata(Thunb.)Koidz.)的三萜皂苷合成途径及其关键酶,本研究对其花、叶、根、茎进行转录组测序,组装获得了57.25 Gb数据,含140859个unigenes,序列平均长度为1350 bp。KEGG代谢通路富集结果显示,517个unigenes参与三萜皂苷合成相关的3条代谢途径,其中415个unigenes编码三萜皂苷生物合成途径的19个关键酶。对三萜皂苷生物合成过程中的关键酶角鲨烯环氧酶(SE)进行序列分析和同源建模,发现其具有保守的底物结合结构域。将三叶木通茎与花、叶、根的基因表达水平进行比较,发现茎与根相比较其上调基因数目最多,其中295个差异表达基因(DEGs)与三萜皂苷生物合成途径相关。

蛇床子三螺旋转录因子基因的克隆与表达分析

研究的目的是克隆中药蛇床子[Cnidium monnieri(L.)Cuss.]三螺旋转录因子(Trihelix transcription factor,ttf)基因,诱导、鉴定其蛋白体外表达,并利用生物信息学方法分析该蛋白的结构和性质。主要采用RT-PCR方法扩增目的基因,连接到p MDTM19(Simple)-T克隆载体中,核酸序列鉴定正确后再将目的基因克隆到p ET-22b(+)表达载体上,将获得的重组质粒转化到大肠杆菌E.coli BL21细胞中,以不同浓度的诱导剂诱导其表达,进一步利用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹方法检测目的蛋白的表达情况,并利用各种生物学软件对目的蛋白进行生物信息学分析。结果获得了ttf,构建了该基因的克隆和表达重组质粒,该基因在大肠杆菌BL21中能够被诱导表达,Western Blot结果表明,在预计的分子质量21 ku位置得到了目的蛋白;生物信息学分析表明,目的蛋白为可溶性蛋白,可能定位于细胞核和线粒体中;部分区域极有可能形成卷曲螺旋。研究首次成功体外克隆并在原核生物中表达了蛇床子三螺旋转录因子,并对其进行了系统的生物信息学分析,为进一步研究其结构和功能奠定了基础。

重楼皂苷Ⅱ诱导人胃癌MGC-803细胞凋亡的体外研究

目的初步探讨重楼皂苷Ⅱ抑制人胃癌MGC-803细胞增殖并诱导其凋亡的作用及机制。方法体外培养人胃癌MGC-803细胞,CCK-8法检测不同浓度的重楼皂苷Ⅱ作用于细胞后其存活率;DAPI染色观察细胞凋亡;AV/PI双染检测细胞凋亡率;比色法检测天冬氨酸蛋白水解酶caspase-3的活性;Western blot法检测Cyt-c的蛋白表达水平。结果与正常对照组相比,重楼皂苷Ⅱ可降低MGC-803细胞的存活率,且呈剂量与时间依赖性;镜下可见细胞核破碎,具有明显凋亡特征,凋亡率随着浓度的增大而增加(P <0.01);细胞内caspase-3的活性增加(P <0.01),Cyt-c蛋白的表达量明显增加(P<0.01)。结论重楼皂苷Ⅱ可明显抑制人胃癌MGC-803细胞的增殖,并诱导细胞发生凋亡。

吡拉格雷钠对脑缺血再灌注损伤模型大鼠神经功能的改善作用及机制研究

目的:研究吡拉格雷钠对脑缺血再灌注损伤模型大鼠神经功能的改善作用及相关机制。方法:将72只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性对照组(地佐环平0.8 mg/kg)和吡拉格雷钠低、中、高剂量组(20、30、45 mg/kg),每组12只。除假手术组大鼠行假手术外,其余各组大鼠均采用大脑中动脉结扎诱导脑缺血再灌注损伤模型。术后2 h尾静脉注射相应药物,假手术组和模型组大鼠注射等量生理盐水,连续给药6 d,给药间隔均为24 h。再灌注24 h和末次给药后,评估大鼠的神经功能缺陷评分和姿势反射评分,采用微正电子发射断层扫描评估脑损伤情况(包括全脑、岛状皮层、壳核、纹状体、体细胞皮层、杏仁核、运动皮层)。然后处死大鼠,2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色后观察脑梗死情况并计算脑梗死体积,酶联免疫吸附试验检测其脑组织中Na^+-K^+-ATP酶、Ca^(2+)-ATP酶活性和谷氨酸(Glu)含量。结果:与假手术组比较,模型组大鼠缺血再灌注后24 h和末次给药后的神经功能缺陷评分、姿势反射评分均明显升高(P<0.05或P<0.01),脑缺血再灌注24 h与末次给药后脑组织的SUV、全脑及各不同脑区的右左脑SUV比值均明显降低(P<0.01);末次给药后脑梗死体积百分数明显升高(P<0.01),脑组织中Na^+-K^+-ATP酶和Ca^(2+)-ATP酶活性明显降低(P<0.01),Glu含量明显升高(P<0.01)。与模型组比较,吡拉格雷钠低、中、高剂量组和阳性对照组大鼠上述指标均明显改善(P<0.05或P<0.01)。结论:吡拉格雷钠对大鼠脑缺血再灌注损伤和神经功能有改善作用,这可能与上调脑组织中Na^+-K^+-ATP酶和Ca^(2+)-ATP酶活性和下调Glu含量有关。

人参灵芝胶囊缓解体力疲劳小鼠的试验

[目的]考察人参灵芝胶囊缓解实验性小鼠体力疲劳的作用。[方法]小鼠连续灌胃给予不同剂量(0.9、0.6、0.3 g/kg)的人参灵芝胶囊,阴性对照组给予等量蒸馏水。连续灌胃30 d后,测定小鼠负重游泳时间、运动后血清尿素含量、血乳酸含量、肝糖原含量。[结果]与阴性对照组比较,高、中剂量组小鼠负重游泳时间显著延长,各给药组血清尿素含量明显降低,各给药组肝糖原含量明显升高,中剂量组小鼠游泳后20 min血乳酸值和血乳酸曲线下面积显著降低。[结论]人参灵芝胶囊具有缓解体力疲劳的作用。

槐糖脂通过线粒体途径诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡的机制

目的探讨槐糖脂抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖的作用,并阐明其诱导SGC-7901细胞线粒体凋亡的机制。方法不同浓度(40,80,160,320μg/ml)槐糖脂作用于人胃癌SGC-7901细胞,与未加槐糖脂处理的空白对照组进行比较,观察各浓度槐糖脂作用组中人胃癌SGC-7901细胞的变化。倒置显微镜观察槐糖脂作用后细胞活力变化,并采用CCK-8法检测各浓度槐糖脂作用后细胞的存活率; DAPI染色,荧光显微镜观察槐糖脂作用后细胞形态变化;罗丹明123(Rhodamine 123)染色,流式细胞术检测槐糖脂作用组及未加槐糖脂处理的空白对照组细胞内线粒体膜电位水平;采用Western blot检测各组Bcl-2、Bax、Cyt-C、Caspase 3及Caspase 9蛋白表达水平。结果与空白对照组比较,槐糖脂作用组人胃癌SGC-7901细胞活力下降,细胞存活率显著降低(P <0. 05),且降低程度与槐糖脂剂量成正相关,细胞形态呈现明显的凋亡样改变;与空白对照组比较,槐糖脂作用组人胃癌SGC-7901细胞线粒体膜电位显著降低(P <0. 05),Bax蛋白的表达量明显增加(P <0. 05),Bcl-2蛋白表达显著降低(P <0. 05),Cyt-C、Caspase 3及Caspase 9蛋白水平显著升高(P <0. 05)。结论槐糖脂能够抑制人胃癌SGC-7901细胞的增殖,其机制可能是通过线粒体凋亡途径诱导细胞发生凋亡。

表儿茶素对四氯化碳诱导肝纤维化大鼠的干预作用

目的研究表儿茶素对四氯化碳诱导大鼠肝纤维化的保护作用。方法将80只雄性SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、秋水仙碱组(0.1mg/kg)、表儿茶素高剂量组(100mg/kg)、表儿茶素低剂量组(25mg/kg)。除正常对照组腹腔注射橄榄油外,其余各组均腹腔注射四氯化碳(CCl4)建立肝纤维化模型。复制模型的同时开始给药,各给药组大鼠灌胃相应药物,正常对照组和模型组大鼠灌胃等容积生理盐水,每日1次,连续6周。末次给药后,称取肝湿质量,计算肝脏指数;采用微板法检测大鼠血清中天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)水平;苏木精-伊红染色和Masson胶原染色观察肝脏病理学变化;Western blot法检测肝脏中平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA)、Ⅰ型胶原(typeⅠcollagen,collα1)蛋白的表达水平。结果与模型组相比,表儿茶素能显著降低大鼠的肝脏指数和血清ALT、AST的含量;显著降低肝组织中α-SMA、collα1蛋白的表达;肝组织病理学指标明显改善。结论表儿茶素对四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化有一定的保护作用,其机制可能与抑制α-SMA、collα1的表达有关。

新藤黄酸诱导脑胶质瘤细胞U87自噬的研究

目的观察不同浓度新藤黄酸(gambogenic acid,GNA)对脑胶质瘤细胞U87增殖及自噬的影响。方法倒置显微镜下观察细胞形态变化,采用噻唑蓝法检测细胞的存活率,单丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine,MDC)染色法检测自噬泡的形成,吖啶橙(acridine orange,AO)染色流式细胞仪观察酸性囊泡细胞器的数量变化,Westernblot法检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein 1 light chain 3,LC3)-Ⅱ/LC3-Ⅰ以及Beclin-1的表达变化。结果 GNA在1~32 μmol/L浓度范围抑制U87细胞的增殖;MDC染色表明GNA促进U87细胞内自噬泡的形成;AO染色表明GNA增加U87细胞内酸性囊泡细胞器的数量;Western blot结果显示,GNA作用U87细胞后,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增大,Beclin-1的表达增加,提示细胞内自噬活性增强。结论 GNA在一定剂量和时间范围内抑制脑胶质瘤细胞U87细胞的增殖可能与诱导U87细胞自噬的发生有关。

多花黄精果糖激酶和GDP-甘露糖焦磷酸化酶的基因克隆及酶结构性质

多花黄精(Polygonatum cyrtonema Hua,PC)果糖激酶(PCFRK)和GDP-甘露糖焦磷酸化酶(PCGMPP)是黄精多糖生物合成中重要的关键酶,为探究它们在黄精多糖生物合成途径中的作用,基于转录组测序数据分析,利用RT-PCR技术对这两种关键酶基因进行克隆,并分析酶蛋白的理化性质及结构特点。PCFRK开放读码框(ORF)为1725 bp,编码574个氨基酸,具有两个磷酸果糖激酶B家族的特征保守基序;PCGMPP的ORF为1086 bp,编码361个氨基酸,具有焦磷酸化酶家族的保守位点和活性位点。系统进化树分析发现在已知数据库中PC FRK与深圳拟兰FRK亲缘关系最近;而PC GMPP与芦笋GMPP亲缘关系最近。基因表达分析说明PCFRK和PCGMPP在根状茎中的基因表达总量明显高于其他组织,这与多花黄精根茎中多糖含量高于其他组织是一致的。研究为PCFRK和PCGMPP两种关键酶功能的进一步研究及黄精多糖生物合成途径的解析奠定基础。

酸枣仁皂苷A对脂多糖诱导星形胶质细胞C6氧化损伤的保护作用

目的采用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导星形胶质细胞C6的氧化应激模型,以研究酸枣仁皂苷A(Jujuboside A,JuA)的抗氧化活性。方法体外培养大鼠星形胶质细胞C6。采用MTT法检测各组细胞的存活率,采用Western blot法检测星形胶质细胞标记蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的活化情况,采用Griess还原法测定细胞上清液中一氧化氮(nitric oxide,NO)水平,采用流式细胞术检测各组细胞中活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,采用ELISA测定各组细胞内丙二醛(malondialdehyde,MDA)和谷胱甘肽(L-glutathione,GSH)水平以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性。结果 0.125~50μmol/L JuA对C6细胞存活率无明显影响(P>0.05);1μg/mL LPS可以明显升高C6细胞GFAP蛋白表达水平,显著升高细胞上清液中NO和细胞内ROS、MDA水平,降低细胞内GSH水平和SOD活性,差异均有统计学意义(P<0.05)。与LPS组比较,12.5、25、50μmol/L JuA可以明显抑制LPS诱导的GFAP表达,降低细胞上清液中NO水平,降低细胞内ROS、MDA水平,升高细胞内GSH水平和SOD活性,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 JuA对LPS诱导的星形胶质细胞氧化损伤具有一定的保护作用。

新藤黄酸对人胃癌SGC-7901细胞增殖抑制和诱导凋亡作用的研究

目的观察不同浓度新藤黄酸(gambogenic acid,GNA)对人胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响。方法倒置光学显微镜下观察不同浓度GNA处理SGC-7901细胞24h后细胞形态的变化;采用MTT法检测不同浓度(0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0μmol/L)GNA处理24h后人胃癌SGC-7901细胞活力的变化;AnnexinⅤ-FITC/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率;Western blot检测凋亡相关蛋白p53和Caspase-9的表达水平。结果 MTT检测结果表明,GNA对人胃癌SGC-7901细胞的生长和增殖有抑制作用,并随着GNA浓度的增加细胞活力明显下降。流式细胞仪检测结果提示,GNA诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡,随着GNA浓度增加,凋亡率逐渐增加。Western blot表明p53和Caspase-9蛋白表达水平呈浓度依赖性升高。结论 GNA能诱导人胃癌SGC-7901细胞的凋亡。

新藤黄酸抑制人肝癌细胞BEL-7402自噬作用研究

目的观察新藤黄酸(gambogenic acid,GNA)对人肝癌细胞BEL-7402自噬的影响,为GNA抗肿瘤研究提供理论依据。方法体外培养人肝癌BEL-7402细胞株,采用MTT法检测GNA对人肝癌细胞BEL-7402存活率的影响;倒置显微镜观察给药前后细胞形态变化;单丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine,MDC)染色,荧光显微镜观察细胞自噬小体;透射电子显微镜进一步观察自噬小体;Western blot法检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein 1light chain 3,LC3)和p62、Beclin1的表达水平及加入自噬诱导剂雷帕霉素(rapamycin,Rap)和自噬抑制剂氯喹(chloroquine,CQ)后自噬相关蛋白的表达情况。结果 GNA能显著抑制人肝癌细胞BEL-7402的增殖并呈时效及量效关系;倒置显微镜观察结果显示GNA组细胞随药物浓度增大,细胞悬浮增多,高浓度给药组细胞出现碎片化;荧光显微镜下观察结果显示,随药物浓度的增加,荧光点状聚集增多;透射电子显微镜观察发现,随GNA浓度的增加,细胞内自噬空泡数量增多,与对照组比较,加入自噬诱导剂Rap后,自噬空泡数量显著增多;Western blot法检测结果显示,随GNA浓度的增加,Beclin1、p62、LC3-Ⅱ蛋白表达水平均增加(P<0.05),LC3-Ⅰ无明显变化,表明BEL-7402细胞自噬前期被激活,后期进程被抑制。结论 GNA能抑制人肝癌细胞BEL-7402的增殖,其机制可能部分是通过抑制自噬后期自噬体与溶酶体的融合,抑制人肝癌BEL-7402细胞的保护性自噬。

新藤黄酸诱导卵巢癌A2780细胞凋亡的作用研究

目的研究新藤黄酸对卵巢癌细胞增殖的抑制作用及其可能的机制。方法采用MTT检测新藤黄酸对卵巢癌A2780细胞存活率的影响,采用fluo-3AM染色荧光显微镜观察新藤黄酸对A2780细胞钙离子水平的影响,采用Hoechst 33342染色荧光显微镜观察细胞的凋亡率,采用PI染色流式细胞仪检测新藤黄酸对细胞周期的影响,采用AnnexinⅤ-FITC/PI染色流式细胞仪检测新藤黄酸对细胞凋亡率的影响,采用Western blot检测凋亡相关蛋白表达的影响。结果 MTT检测结果表明,新藤黄酸对卵巢癌细胞A2780的增殖具有抑制作用,且抑制作用具有明显的剂量依赖性;fluo-3AM染色荧光显微镜下观察,可见各浓度新藤黄酸均能升高A2780细胞内钙离子水平,且呈现浓度依赖关系;PI染色流式细胞仪检测结果表明,新藤黄酸能阻滞A2780细胞于G0/G1期;Hoechst 33342染色和AnnexinⅤ-FITC/PI染色流式细胞仪检测结果表明,随着新藤黄酸浓度的增加,A2780细胞凋亡率呈现增高的趋势;Western blot检测结果表明,新藤黄酸可以促进凋亡相关蛋白p53、细胞色素C以及Caspase-9表达水平升高。结论新藤黄酸具有抑制卵巢癌A2780细胞增殖和诱导肿瘤细胞发生线粒体凋亡的作用。

基于小RNA测序的风轮菜microRNA及其靶基因分析

本研究以风轮菜(Clinopodium chinense(Benth.)O.Kuntze)为材料,采用BGISEQ-500测序平台对风轮菜根、茎和叶的小RNA进行转录组测序,并对其黄酮类物质合成途径中参与调控的microRNA(miRNA)及其靶基因进行了分析。结果显示,鉴定出的保守miRNA有86个,属于26个家族,新发现miRNA 8个,筛选出风轮菜黄酮类物质合成途径中调控3个关键酶的候选miRNA(novel_mir3、miR167d-5p、miR396h)。通过对靶基因编码的关键酶4-香豆酸辅酶A连接酶进行序列分析和同源建模,发现其具有高度保守的底物结合区域、催化结构域及两个保守的肽基序。

异叶天南星凝集素基因的克隆及蛋白的结构性质分析

克隆了中药材异叶天南星(Arisaema heterophyllum Blume)叶中凝集素(lectin)基因(Ahltn)的开放阅读框(ORF),并对其编码蛋白AhLTN的性质和结构进行了分析。首先从植物异叶天南星的新鲜叶片中提取总RNA,通过逆转录获取cDNA,经PCR扩增Ahltn后与pMD19-T载体连接构成重组质粒,然后转化到大肠杆菌感受态细胞中培养,经菌液PCR鉴定后再进行测序验证,确定目的基因被成功克隆,进一步运用各种生物信息学软件对AhLTN的理化性质、进化关系和空间结构进行分析。结果显示,克隆获得了Ahltn的ORF,此基因片段长度为561 bp,编码186个氨基酸的蛋白质,经生物信息学分析AhLTN属于稳定蛋白,AhLTN与铁皮石斛的凝集素亲缘关系最近,四级结构显示其为二聚体,且两个单体的C末端发生了交换,每个单体中含有11个β折叠,呈“三棱镜”型,3个面均有保守的甘露糖结合区域。为天南星植物凝集素基因和蛋白功能的进一步研究和开发利用奠定了基础。

清咽口服液治疗慢性咽炎的临床观察

目的考察清咽口服液治疗慢性咽炎的临床效果。方法将慢性咽炎患者108例随机分为治疗组54例和对照组54例,治疗组服用清咽口服液,对照组采用空白对照。结果与对照组比较,治疗组咽部症状改善率均显著升高(P <0.01),总积分显著降低(P <0.01);治疗组前后自身配对比较,咽部症状总积分低于服用前(P <0.01);与对照组比较,治疗组咽后壁滤泡增生、黏膜水肿的改善率显著升高(P <0.05),总积分显著降低(P <0.01);治疗组前后自身配对比较,咽部症状总积分低于服用前,差异有统计学意义(P <0.01)。结论清咽口服液对慢性咽炎有一定的治疗效果。