基于HSPA5/GPX4信号通路探讨针刀干预膝关节骨关节炎兔软骨细胞铁死亡的作用机制

目的:观察针刀疗法对膝关节骨关节炎(KOA)兔膝关节软骨细胞热休克蛋白A家族成员5(HSPA5)/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)信号通路的影响,探讨针刀干预KOA软骨细胞铁死亡的作用机制。方法:将27只新西兰兔随机分为正常组、模型组和针刀组,每组9只。采用改良Videman法连续固定兔左侧后肢6周建立KOA模型。造模后,针刀组给予针刀干预,每周1次,连续3周。运用奎森功能障碍指数(Lequesne MG评分)评估兔膝关节局部症状、体征及功能;HE染色法与番红-固绿染色法分别观察兔软骨细胞与组织形态;透射电镜观察兔软骨细胞线粒体结构;运用铁离子试剂盒检测兔软骨组织铁含量;流式细胞仪检测兔软骨组织线粒体膜电位(Δψm)和活性氧(ROS)水平,并计算线粒体损伤率;实时荧光定量PCR检测兔软骨组织HSPA5、GPX4、Ⅱ型胶原α1链(COL2A1)、基质金属蛋白酶(MMP)3、MMP13 mRNA表达;Western blot法检测兔软骨组织HSPA5、GPX4、Ⅱ型胶原蛋白(COL-Ⅱ)、MMP3、MMP13蛋白表达;免疫荧光法检测兔软骨组织HSPA5、GPX4平均荧光强度。结果:干预前,与正常组比较,模型组和针刀组兔膝关节Lequesne MG评分升高(P<0.01);干预后,与模型组比较,针刀组兔膝关节Lequesne MG评分降低(P<0.01)。与正常组比较,模型组兔膝关节软骨细胞数量减少且排列紊乱,软骨结构层次不清,潮线紊乱、模糊不清,线粒体皱缩、线粒体嵴减少甚至消失;与模型组比较,针刀组软骨细胞数量较多,软骨结构层次清楚,潮线恢复,线粒体数量较多,结构正常,有较多的嵴。与正常组比较,模型组软骨组织铁含量增加(P<0.01),细胞呈低Δψm,线粒体损伤率增高(P<0.01),ROS平均荧光强度升高(P<0.01),软骨组织HSPA5、GPX4、COL2A1 mRNA及相应蛋白表达降低(P<0.01),软骨组织MMP3、MMP13 mRNA及蛋白表达升高(P<0.01),软骨组织HSPA5、GPX4平均荧光强度降低(P<0.01);与模型组比较,针刀组软骨组织铁含量减少(P<0.01),软骨细胞Δψm升高,线粒体损伤率降低(P<0.01),ROS平均荧光强度降低(P<0.01),软骨组织HSPA5、GPX4、COL2A1 mRNA及相应蛋白表达升高(P<0.01),软骨组织MMP3、MMP13 mRNA和蛋白表达降低(P<0.01),软骨组织HSPA5、GPX4平均荧光强度升高(P<0.01)。结论:针刀干预能够缓解KOA模型兔膝关节软骨损伤,其机制可能与调节HSPA5/GPX4信号通路维持关节软骨铁稳态,从而抑制软骨细胞铁死亡,缓解细胞外基质(ECM)降解有关。