家蚕G蛋白γ1亚基(BmGγ1)的克隆及其谷胱甘肽硫转移酶融合蛋白的表达与纯化

异三元G蛋白是真核细胞感知外界信号后将信号传递到胞内的重要分子,参与生物体广泛的信号转导。为了研究家蚕体内G蛋白的生理功能及其作用机制,运用生物信息学方法预测了家蚕G蛋白γ1亚基(Gγ1)的序列,设计引物验证预测序列后,克隆了家蚕Gγ1的序列,再通过酶切克隆至表达载体pET-41b(+)后,导入E.coliBL21宿主菌中,经异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组谷胱甘肽硫转移酶(glutathione s-transferase,GST)融合蛋白,并亲和层析纯化表达产物。家蚕Gγ1重组GST融合蛋白经SDS-PAGE电泳和Western blot分析,在分子质量约36 kD处出现特异性蛋白条带,重组蛋白经GST亲和层析柱纯化后,得到了高纯度的融合蛋白,说明已经成功克隆到家蚕Gγ1基因,并在E.coliBL21中高效表达。

家蚕G蛋白α亚基基因BmGα73B的克隆与表达

异三元G蛋白是真核细胞感知外界信号后将信号传递到胞内的重要分子,在生物中参与了广泛的信号转导途径,如光、神经递质和激素等。为了研究G蛋白在家蚕Bombyxmori中的生理功能及其作用机理,我们运用生物信息学方法在已有的家蚕基因组数据库中找到了一段与G蛋白alpha亚基(Gα)同源性很高的序列。通过设计特异性引物,运用PCR和RACE技术,成功地克隆了一个家蚕Gα基因的全长cDNA序列。该基因全长1509bp(GenBank登录号:EU914850),开放阅读框(ORF)为1158bp,编码385个氨基酸。Blast和DNAstar等软件分析发现该基因编编码的蛋白质与其他物种已知的Gα具有一定的保守性,将它命名为BmGα73B。RT-PCR扩增检测该基因在家蚕不同组织器官和不同发育时期的转录表达活性,结果表明它在不同发育时期的家蚕各组织器官中都有表达。从组织水平上看,BmGα73B在中肠中表达量最高,在马氏管、头部和神经索等组织中也有适量表达。在家蚕的不同发育时期中,转录水平峰值出现在幼虫期,在蛹早期也有适量的表达,而在预蛹期、蛹后期和成虫期几乎没有表达。结果说明BmGα73B可能参与了家蚕生长前期的中肠发育过程,为进一步研究G蛋白在家蚕发育过程的作用奠定了一定的基础。