褪黑素对动脉粥样硬化模型兔动脉肌球蛋白轻链激酶表达及活性的影响

目的探讨褪黑素(melatonin,MLT)对动脉粥样硬化模型兔动脉肌球蛋白轻链激酶(MLCK)表达与活性的影响。方法复制动脉粥样硬化兔模型,采用免疫组化和Western blot分析主动脉MLCK蛋白表达,γ-32P-ATP参入法检测MLCK活性。结果成功建立动脉粥样硬化兔模型,高脂喂食12wk,兔主动脉MLCK蛋白表达水平增加,活性上升,经MLT治疗后动脉粥样硬化斑块减少,MLCK蛋白表达下降,活性下降。结论动脉粥样硬化的形成与MLCK蛋白表达与活性升高有关,MLT能降低动脉MLCK蛋白表达和活性。

维生素E对动脉粥样硬化兔动脉肌球蛋白轻链激酶活性及内膜通透性的影响

目的 :探讨维生素 E(Vit E)对动脉粥样硬化兔动脉肌球蛋白轻链激酶 (ML CK)活性及内膜通透性变化的影响。方法 :复制兔动脉粥样硬化模型 ,用γ 32 P掺入法检测动脉 ML CK活性 ,免疫荧光检测内膜通透性 ,同时用苏木精伊红 (HE)染色观察动脉壁的形态结构。结果 :在喂饲胆固醇膳食 4周的动物组 ,动脉 ML CK活性与正常对照组比较显著升高 (P<0 .0 5 ) ;但在喂饲胆固醇膳食 12周或同时添加 Vit E后 ,动脉 ML CK活性与正常对照组比较升高不明显 (P>0 .0 5 )。荧光显微镜下观察显示 ,兔动脉内膜通透性在喂饲胆固醇膳食后 4周有所增加 ,12周后显著增加 ;12周组膳食中同时加 Vit E后 ,通透性有所下降。结论 :在动脉粥样硬化早期 ,内膜屏障完整性的改变可能与 ML CK活性增强有关 ,Vit E可能是降低动脉内膜 ML CK活性的因素 ,并能降低动脉粥样硬化模型兔动脉内膜通透性。

动脉粥样硬化兔模型血液中乳酸脱氢酶和肌酸激酶的动态分析

目的 分析实验性动脉粥样硬化 (atherosclerosis,AS)大耳白兔血液中乳酸脱氢酶和肌酸激酶的变化规律。方法 建立兔动脉粥样硬化模型 ,检测模型各阶段血液中各种脂质、AST、ALT、LDH、CK、Bun、Cre等生化指标。结果 成功地建立了动脉粥样硬化兔模型 ;大白兔在喂食高胆固醇饲料 4周或 12周时 ,血液中总胆固醇 (CHO)和低密度脂蛋白胆固醇 (LDL ch)浓度升高 (P <0 0 5 ) ;AST、ALT的活性和Bun、Cre的含量变化差异无显著性 (P >0 0 5 ) ;而LDH和CK的活性随着动脉粥样硬化的进程而逐渐升高 ,变化差异有显著性 (P <0 0 5 ,ASa组和ASb组的LDH活性分别比对照组升高 2 2倍和 3 5倍 ,CK的活性则分别增加 2 4倍和 7 5倍。VitE组与ASb组比较 ,LDH和CK的活性都显著下降 (P <0 0 5 )。结论 提示血清LDH和CK的活性升高与动脉粥样硬化的进程相关 ;

Vit E对动脉粥样硬化模型兔动脉肌球蛋白轻链激酶表达的影响

目的 研究动脉粥样硬化 (AS)模型兔动脉肌球蛋白轻链激酶表达的变化以及VitE对MLCK表达的影响。方法 复制AS兔模型 ;颈动脉取血后检测血清标本中各种血脂成分的变化 ,用免疫组化法和Westernblot分析动脉粥样硬化模型兔动脉MLCK的表达。结果 成功建立AS兔模型 ,模型血清中各种脂质发生显著变化。免疫组化和West ernblot实验表明 ,动脉粥样硬化模型兔在喂食胆固醇膳食 4wk和 12wk后动脉MLCK的表达增强 ,在喂食胆固醇膳食12wk同时添加VitE时 ,MLCK表达降低。结论 AS模型兔动脉MLCK的表达增强与动脉粥样硬化的形成相关。VitE可能是降低动脉MLCK表达的因素 ,同时抑制动脉粥样硬化的形成。

兔骨骼肌肌球蛋白轻链的分离纯化

目的从兔骨骼肌中提取肌球蛋白轻链，为下一步研究肌肉收缩原理提供可磷酸化的底物。方法用离心、透析、柱层析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和电泳转移等方法纯化兔骨骼肌肌球蛋白轻链。结果提取纯化得到较纯的肌球蛋白，进一步得到轻链混合液和各种轻链纯品，经紫外吸收检测及SDS0PAG证实其分子量分别为25000（MLC1）、19000（MLC2）和16500（MLC3），均与文献报道基本一致。结论研究所用的方法可行，所得到的肌球蛋白及其轻链样品较纯，可用于下一步实验。

VitE对动脉粥样硬化模型兔肝脏肌球蛋白轻链激酶活性及表达的影响

目的 探讨维生素E(VitE)对动脉粥样硬化模型兔肝脏MLCK活性及表达的影响。方法 复制兔动脉粥样硬化模型 ,用γ 3 2 P参入法检测肝脏MLCK活性 ,免疫荧光法检测肝组织MLCK的表达。结果 动脉粥样硬化兔模型建立成功 ,在喂胆固醇 4wk及 12wk的动物组 ,肝脏MLCK活性[分别为 (1884 8 7± 74 34 3)、(18818 3± 346 9 9)cpm·mg-1protein]与正常对照比较 [(6 6 77 5± 10 9 6 0 )cpm·mg-1pro tein]升高 (P <0 0 5 ) ;但在喂胆固醇同时添加VitE后 ,肝脏MLCK活性 [(10 898 8± 2 0 4 1 2 )cpm·mg-1protein]与正常对照组比较升高不明显 (P >0 0 5 )。荧光显微镜下观察显示 ,兔肝在喂食胆固醇膳食 4wk后MLCK的表达有所增强 ,12wk后显著增强 ,12wk组的膳食中同时加VitE后 ,MLCK表达有所下降。结论 在动脉粥样硬化过程中 ,肝脏病变可能与MLCK活性增强有关 ,VitE可能是降低肝脏MLCK活性的因素 。

ESM-1在转染MEK基因的ECV304细胞中的表达

目的探讨内皮细胞特异性分子-1(ESM-1)在转染MEK基因的人脐静脉内皮细胞中的表达,探讨ESM-1的表达是否受分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信号转导通路的调节。方法脂质体转染高活性的MEK基因入ECV304细胞,Westernblot检测ESM-1在ECV304细胞中的表达。结果成功获得稳定转染高活性MEK基因的细胞株,并检测到胞外信号调节的激酶(ERKs)的表达量在二株细胞中没有变化,而pERK-2和ESM-1在转染MEK基因的细胞中表达高于未转染的细胞。结论ESM-1可能处于ERK-2的下游,其表达可能受MAPK信号转导通路的调节。

早期糖尿病大鼠肾脏肌球蛋白轻链激酶表达

目的观察早期糖尿病大鼠肾脏肌球蛋白轻链激酶(MLCK)表达及意义。方法腹腔注射链尿佐菌素(65mg/kg)诱发糖尿病模型,应用胰岛素控制血糖,心脏取血检测血糖及肾功能相关指标。通过免疫组化与Western-blot检测肾组织肌球蛋白轻链激酶表达。结果与正常对照组相比,模型组血糖及肾功能相关指标发生显著性变化。正常组肾小球、肾小管及肾脏血管均有MLCK的表达。模型组与正常对照组相比,肾小球表达MLCK有一定的减弱,治疗组与正常对照组相比无明显变化。结论早期糖尿病肾病形成可能是由于肌球蛋白轻链激酶表达降低所致。胰岛素治疗糖尿病肾病机制可能是增加肾脏肌球蛋白轻链激酶的表达。

质粒的制备

随着人类基因组计划的顺利进行 ,一个更为广阔且具活力和应用前景的研究领域人类基因组后计划已形成 ,并吸引全世界顶尖科学家和实验室参与。人类基因组后计划的研究内容主要涉及功能基因的分离、鉴定 ,其编码蛋白质的生物学功能及其可应用研究。本领域所采用的研究方法主要包括分子生物学、蛋白质组学和功能蛋白质学等实验方法。其中 ,分子生物学常用实验方法在研究中使用最广 ,可变性最大 ,且可选择最多。为提高我校广大科学研究者对分子生物学技术和实验方法有一较全面的了解和知晓本校可用的资源 ,特邀请本校分子生物学中心试验室根据其研究工作撰写有关分子生物学常用实验方法的介绍 ,并陆续在本刊上发表 。

全反式维甲酸对角膜上皮损伤修复过程中细胞凋亡的影响

目的探讨全反式维甲酸(ATRA)对大鼠角膜上皮损伤修复过程中细胞凋亡的影响,及其可能机制。方法建立大鼠角膜上皮损伤修复模型,ATRA溶液角膜点滴,拍照记录角膜损伤修复情况,并观察ATRA对大鼠角膜损伤修复速度的影响;原位末端凋亡法(TUNEL技术)测定损伤修复过程中角膜组织细胞凋亡情况;Western blot法测定ATRA处理后角膜上皮组织中丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路蛋白以及细胞凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(Bax)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、半胱天冬氨酸蛋白酶-3前体(Procaspases-3)、半胱天冬氨酸蛋白酶-3(Caspases-3)、Procaspases-9、Caspases-9表达水平。结果 0.5 mmol/L ATRA点滴处理损伤后角膜可促进角膜上皮损伤修复,可调节角膜上皮组织中MAPK信号通路p38的磷酸化水平;能有效抑制促凋亡蛋白Bax表达(P<0.05),上调凋亡抑制蛋白Bcl-2表达(P<0.05),表现出一定的抗凋亡作用;同时上调Procaspases-9、Procaspases-3表达(P<0.05),下调Caspases-3、Caspases-9表达(P<0.05)。结论 ATRA促进大鼠角膜上皮损伤修复的作用与其抑制角膜上皮组织细胞凋亡有关,其可能的机制与MAPK通路相关蛋白的激活有关。

miR-155对SD大鼠晶状体上皮凋亡抑制作用的初步研究

目的研究微小核糖核酸(miR)-155对高糖诱导的人晶状体囊膜上皮细胞(HLEpiC)和SD大鼠晶状体细胞凋亡的抑制作用。方法晶状体取自正常SD大鼠,晶状体直接进行体外分组培养,晶状体培养组与细胞培养分组相同,培养时间为72 h。低糖(LG)培养基处理HLEpiC至密度为30%～40%,设置不同的培养组来进行加药处理,培养组包括:5.5 mmol/L低糖(LG)培养基组,25 mmol/L甘露醇,25 mmol/L高糖(HG)培养基组,模拟生物体内源的miR-155用药组(mimic),药物对照组(CTm)。用药组分别加入30 nmol/L的miR-155培养48 h。通过Western blot检测不同处理组细胞蛋白和组织凋亡相关蛋白Bcl-2相关X蛋白(Bax)、B细胞淋巴瘤基因2(Bcl-2)以及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)家族相关蛋白caspase-3和caspase-9表达量。结果在模拟生物体内源的miRNAs(mimic)的浓度为30 nmol/L时,可以改变高糖引起的晶状体浑浊。30 nmol/L的mimic对HLEpiC的增殖能力有明显的促进作用。与高糖对照组相比,加药组凋亡相关的表达量有明显的变化,促凋亡蛋白Bax以及凋亡效应蛋白caspase-3的表达量明显下调,而抑凋亡蛋白Bcl-2和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶前体蛋白(procaspase-9)表达量明显上调。结论 miR-155通过抑制细胞凋亡的发生来抑制由高糖引起的HLEpiC和SD大鼠晶状体细胞凋亡的发生。