血液科临床医师流式细胞术专科诊断能力的培养

近年来,流式细胞术在血液病的诊断、治疗、疗效的监测和预后评估等方面发挥着重要的作用。该文探讨临床流式细胞术的教学问题。通过流式细胞术的理论教学、上机操作、结合临床典型和疑难病例讨论教学,从而提高血液科临床医师的流式细胞术的专科诊断能力。结果表明取得了较好的临床教学效果,这种教学方式能有效地提高临床医师的血液病诊治水平。

G-CSF动员后异基因骨髓联合外周血干细胞移植治疗血液病

目的探讨粒细胞集落刺激因子（G-CSF）动员的异基因骨髓与外周血干细胞混合移植后造血重建、移植物抗宿主病（GVHD）、复发及生存情况。方法45例血液病患者进行了动员后的异基因骨髓联合外周血干细胞混合移植,人白细胞抗原（HLA）全合37例,1-3个位点不合8例。38例恶性病中32例采用清髓性预处理,6例为减低强度预处理;7例重型再生障碍性贫血（SAA）均采用环磷酰胺联合兔抗人胸腺细胞球蛋白（ATG）及甲泼尼龙预处理。采用环孢素联合霉酚酸酯预防移植物抗宿主病,HLA不全相合患者加用ATG。供者给予G-CSF连续5天皮下注射,注射后第5天采集外周血干细胞,第7天采取骨髓血。结果45例患者均获得快速造血重建,中性粒细胞绝对计数≥0.5×10^9/L,血小板≥20×10^9/L的中位时间分别为移植后的12（8-18）天和16（10-28）天。10例发生了急性GVHD（22%）,Ⅱ度以上1例。可评估的42例患者中16例出现了慢性GVHD,7例为广泛型（16%）。复发9例,死亡11例,其余34例中位随访时间16月（10-46月）,可评估的2年无病生存率为75%。结论G-CSF动员后的异基因骨髓联合外周血干细胞移植治疗血液病可获快速造血重建,移植相关死亡率及重度急、慢性GVHD的发生率低,复发率不增高。

异基因造血干细胞移植治疗高龄恶性血液病的疗效分析

目的探讨异基因造血干细胞移植治疗年龄较大的白血病患者安全性和疗效。方法采用HSCT治疗10例45—63岁恶性血液病患者，HLA6／6位点相合8例，5／6位点相合2例。以清髓性方案预处理4例，减低强度方案预处理6例。HLA不全相合患者加用ATG。采用环孢素联合霉酚酸酯预防移植物抗宿主病（GVHD）。结果本组10例受者均获造血重建。中性粒细胞绝对计数≥0．5×10^9／L，血小板≥20×10^9／L的中位时间分别为移植后12（9～16）天和15（12～21）天。3例发生了急性GVHD（30％），Ⅱ度以上2例。可评估的9例患者中2例出现了慢性GVHD（22％）。复发2例，死亡3例。可评估的2年无病生存率为70％。结论造血干细胞移植对于高龄白血病患者是一种有效、安全的根治疗法。

ABO血型不合非血缘脐血移植治疗恶性血液病患者的输血护理

目的分析ABO血型不合非血缘脐血移植(unrelated cord blood stem cell transplantation,UCBT)治疗恶性血液病患者的输血护理要点。方法对72例恶性血液病患者行ABO血型不合UCBT过程中与输血有关的护理问题,进行回顾性分析和总结。结果 72例ABO血型不合的UCBT均获得造血重建,但存在较外周血和骨髓干细胞移植造血恢复明显迟缓和免疫的问题。结论护士对ABO血型不合UCBT输血技术的掌握及输血相关并发症的预防,是确保安全有效输血的关键。

减低预处理强度的异基因造血干细胞移植治疗恶性血液病疗效观察

本研究探讨减低预处理强度的异基因造血干细胞移植治疗恶性血液病的疗效和并发症。对10例血液系统恶性肿瘤患者进行减低预处理强度的亲缘异基因造血干细胞移植,其中6例CML患者,2例AML患者,1例ALL患者,1例淋巴瘤患者。供者皆为HLA全相合或部分相合同胞,预处理基本方案采用"FLU+CY+TBI"方案并结合患者实际病情适当加以改良,采用"CsA+MMF"方案预防GVHD,移植术后通过骨髓细胞学、染色体、融合基因、ABO血型和STR-PCR方法等监测移植物植入情况以及移植效果,观察移植术后原发病复发、GVHD、移植并发症发生等情况,评估患者生活质量等。结果表明:10例患者全部移植成功,移植物顺利植入,原发病获得治愈。1例患者术后并发肺部严重感染,1例患者出现CMV血症,无其他明显并发症发生。10例患者中出现1例Ⅳ度aGVHD,2例Ⅰ度aGVHD,其余患者无明显GVHD发生。5例患者在移植术后不同时间点出现原发病复发,予以DLI或药物挽救治疗后重回CR状态。随访5月-35月余,10例患者中死亡2例,活存8例,总体生存率为80%,存活患者获得了高质量的生活。结论:减低预处理强度的造血干细胞移植对受者损伤小,移植效果可靠,术后GVHD、移植相关并发症少,患者术后生活质量高,移植后原发病复发患者仍可通过DLI以重新获得完全缓解。

血液病患者PICC置管初期封管液的选择及护理体会

目的:探讨血液病患者中PICC置管初期封管液的选择与护理。方法:将血液病PICC置管初期按封管液随机分为两组,其中A组45例采用生理盐水封管,B组45例采用肝素封管,分别进行临床及护理观察。结果:B组中穿刺点渗出天数及换药次数要明显多于A组,B组堵管例数明显少于A组,但两组穿刺点愈合时间则无明显差别;两组患者凝血功能情况在术前、置管1周及穿刺点愈合后均在正常范围之内,并且两组差异无统计学意义(P>0.05)。结论:在PICC置管初期采用以低浓度肝素封管可以有效减少堵管发生率,且不增加愈合时间,为安全延长留置导管提供有力保障,有着重要的临床意义。

Toll样受体在U937细胞的表达及其作用研究

本研究探讨急性髓系白血病的免疫治疗中以Toll样受体(TLRs)为靶点的可能性,研究人急性髓系白血病U937细胞TLR的表达及TLR8受体激动剂ssRNA40/LyoVec对其增殖、凋亡和细胞周期的影响。运用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测U937细胞TLR1-9mRNA的表达,用流式细胞术检测TLR8的表达。用不同浓度的TLR8激动剂ssRNA40/LyoVec作用于体外培养的U937细胞后,采用CCK-8法检测细胞生长抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期。结果表明:U937细胞表达TLR1-9,TLR8激动剂ssRNA40/LyoVec作用于U937细胞明显地抑制了U937细胞生长,抑制率可达70%,且呈明显的量效关系;作用后处于G0/G1期细胞比例由(44.67±1.05)%增高到(54.08±1.19)%,但凋亡细胞的比例无明显变化。结论:TLR1-9可在U937细胞中表达,TLR8激动剂ssRNA40/LyoVec具有抗肿瘤细胞增殖的作用,使细胞阻滞在G0/G1期,但无明显的促凋亡作用。

急性髓细胞性白血病细胞培养上清对树突细胞分化、成熟、凋亡及功能的影响

背景与目的:树突细胞(dendritic cell,DC)在机体抗瘤免疫中起重要作用。研究已表明肿瘤患者和荷瘤动物体内DC功能受损并伴有DC数量的降低。最近的研究提示这种DC功能的受损可能是肿瘤细胞分泌的可溶性因子介导的免疫抑制所致。本研究拟观察急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)细胞分泌的可溶性因子对单核细胞来源DC的分化、成熟、凋亡及其功能的影响。方法:原代AML细胞培养24h后收集上清。在含有或不含有AML细胞培养上清的培养液中,利用IL-4和GM-CSF刺激单核细胞分化成不成熟DC(immature DC,iDC),IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE-2促进DC成熟。流式细胞仪检测DC表型和凋亡率的变化。计算前体细胞频率(precursor frequency,PF),观察DC对异基因CD4+T细胞和CD8+T细胞的刺激功能。结果:AML细胞培养上清可显著抑制DC表面协同刺激分子CD80和CD86的表达,并可降低促成熟细胞因子对DC的促成熟作用。同时,与对照组相比,AML细胞培养上清可显著诱导DC的凋亡,凋亡率分别为(15.1±4.2)%和(29.4±9.5)%(P<0.01)。相对于正常成熟DC,AML细胞培养上清诱生的DC对异基因CD4+T细胞和CD8+T细胞的刺激功能显著降低(P<0.01),其中CD4+T细胞的前体细胞频率分别为(5.2±1.6)%和(1.8±0.5)%,CD8+T细胞的前体细胞频率分别为(6.5±2.0)%和(2.1±0.6)%。结论:AML细胞分泌的可溶性因子可抑制DC的发育和功能。

脐血造血干/祖细胞部分归巢受体功能缺陷的研究

本研究旨在了解来源于脐血造血干细胞表面部分归巢受体(homing receptor)的功能缺陷并探讨体外干预的效果和可行性。用流式细胞术对来源于脐血的CD34+造血干/祖细胞表面的P、E选择蛋白配体活性基团表达、CD26的表达及活性进行检测,同时检测骨髓和外周血作为对照。采用岩藻糖基转移酶体外处理脐血CD34+造血干/祖细胞并检测其表面选择蛋白配体活性基团的表达水平。结果表明,CD26在脐血、骨髓及外周血的CD34+造血干/祖细胞表面的表达率分别为:(7.62±0.63)%,(6.35±0.89)%和(6.18±0.91)%(p>0.05),其活性分别为:67.15U/1 000个细胞(1U=1pmol/min),26.85U/1 000个细胞和20.95U/1 000个细胞,脐血CD34+造血干/祖细胞表面CD26的活性明显高于其它两者(p<0.001)。P选择蛋白配体活性基团在脐血、骨髓和外周血CD34+造血干/祖细胞表面的表达率分别为:(83.46±6.33)%,(15.65±0.89)%和(80.17±6.85)%;E选择蛋白配体活性基团的表达率为:(25.31±1.03)%,(26.34±0.89)%和(29.79±1.78)%(p>0.05)。脐血CD34+细胞体外行岩藻糖基化工程后,E选择蛋白配体活性基团表达率由(25.31±1.03)%提高至(63.23±1.08)%。结论:3种不同来源CD34+造血干/祖细胞表面的CD26分子表达无明显差别,但其活性不一,脐血的CD34+造血干/祖细胞CD26活性最高,骨髓的次之,外周血的最低。P选择蛋白配体活性基团在脐血及外周血CD34+造血干/祖细胞表面的表达无明显差别,但在骨髓干细胞表面表达偏低。体外经岩藻糖基化工程处理的脐血CD34+造血干/祖细胞可明显上调其表面E选择蛋白配体活性基团的表达。

急性髓细胞性白血病细胞培养上清对CD4^+和CD8^+ T细胞增殖和凋亡的影响

为了研究不同的急性髓细胞性白血病(AML)细胞株培养上清对CD4+和CD8+T细胞增殖以及凋亡的影响,探讨AML的免疫抑制的形成机制,将3种AML细胞株(HL-60、NB4和U937)培养上清和普通培养液按不同比例混合,用于培养CFSE染色的淋巴细胞。抗CD3抗体和抗CD28抗体刺激3天后,标记7AAD和相应荧光抗体。利用流式细胞术检测不同T细胞亚群CFSE荧光强度和7AAD表达率的变化,分析其增殖和凋亡变化情况。结果表明:3种AML细胞株中有2种(HL-60和NB4)培养上清可显著抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖,并随浓度增加而增强。同样,HL-60和NB4细胞株培养上清亦可抑制刺激后的CD4+T细胞的凋亡,但对刺激后的CD8+T细胞的凋亡并无明显影响。相反,HL-60和NB4细胞株培养上清可显著增加增殖的CD8+T细胞的凋亡。结论:AML细胞株培养上清液对CD4+T细胞和CD8+T细胞增殖的抑制以及对增殖的CD8+T细胞凋亡的诱导作用,可能是AML患者免疫功能缺陷的机制之一。

NK细胞活化受体及配体在急性白血病患者外周血中的表达和脱离

本研究旨在从NK细胞活化性受体NKG2D及其相应配体——MICA/B、ULBP-1、2、3的表达和血清中脱离情况来探讨急性白血病患者NK细胞免疫防御功能损伤的可能机制。选择30例初发未治疗的急性白血病患者作为观察对象,10例健康者作为对照,应用流式细胞术检测白血病细胞表面MICA/B,ULBP-1、2、3表达水平,用ELISA法检测血清可溶性MICA、MICB(sMICA,sMICB)及可溶性ULBP1-3(sULBP1-3)水平。结果表明,急性白血病患者NK细胞NKG2D的表达低于正常对照组;急性白血病患者白血病细胞表面不表达或弱表达MICA/B、ULBP1-3;急性白血病患者血清中游离的sMICA和sMICB水平均高于对照组,差异有统计学意义(p<0.01),血清sULBP1-3水平与对照组无明显差异。结论:急性白血病细胞表面MICA和MICB的脱离及ULBP表达缺乏可能是急性白血病细胞发生免疫逃逸的机制之一。

HLA相合同胞供者异基因造血干细胞移植治疗慢性粒细胞白血病40例

背景:异基因造血干细胞移植仍是目前惟一能根治慢性粒细胞白血病的方法。随着移植技术的日臻完善,有HLA相合同胞供者的年轻慢性粒细胞白血病患者只需冒较小的近期风险,便可获得治愈疾病的远期疗效。目的:回顾性分析HLA相合同胞供者异基因造血干细胞移植治疗慢性粒细胞白血病的疗效。设计:回顾性病例分析。对象:选择2002-02/2007-12在安徽省立医院血液科住院接受异基因造血干细胞移植的慢性粒细胞白血病患者40例,男29例,女11例,中位年龄35岁;慢性期30例,加速期5例,急变期5例。供者均为HLA6/6位点配型完全相合的同胞。方法:根据移植方式进行分组:异基因骨髓移植组3例、异基因外周血干细胞移植组8例,联合组29例(异基因外周血干细胞移植+异基因骨髓移植)。预处理方案采用白消安+环磷酰胺或氟达拉滨+环磷酰胺+全身照射2Gy。移植物抗宿主病预防方案为环孢素A+霉酚酸酯。随访中位时间为移植后28个月。主要观察指标:造血功能恢复,移植相关并发症,复发及治疗转归,长期生存情况。结果:40例患者均获造血重建。40例患者中,12例(30%)发生急性移植物抗宿主病,Ⅰ度5例(13%),Ⅱ度6例(15%),Ⅲ度1例(诱发)(3%)。可评估的存活100d以上的39例患者中,15例(39%)出现慢性移植物抗宿主病。与联合组比较,异基因外周血干细胞移植组慢性移植物抗宿主病发生率明显升高(P<0.05)。40例患者中,11例发生Ⅱ度～Ⅲ度迟发性出血性膀胱炎,无急性出血性膀胱炎和肝静脉闭塞病发生。长期无病生存率80%,其中慢性期30例长期无病生存率为87%,5例急变期患者长期无病生存率为20%。加速期5例患者使用伊马替尼达到2次慢性期后进行移植,至今全部无病生存。死亡8例,其中2例死于复发,5例死于移植相关并发症,自杀1例。结论:HLA相合同胞供者异基因造血干细胞移植是治疗慢性粒细胞白血病的有效方法,尤其在慢性期移植效果较好。

NKG2D-MICA/B在急性白血病免疫逃逸机制中的作用

目的探讨NK细胞活化性受体(NKG2D)-MICA/B在急性白血病肿瘤免疫逃逸机制中的作用。方法选择20例初发未治疗的急性白血病患者,应用流式细胞术检测白血病细胞表面MICA/B表达水平、ELISA法检测血清可溶性MICA及MICB(sMICA,sMICB)水平,同时检测患者NKG2D表达水平。选择5例健康人做为对照。结果(1)20例急性白血病患者白血病细胞表面不表达或弱表达MICA/B,正常人淋巴细胞表面不表达MICA/B。(2)患者血清sMICA和sMICB水平均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。(3)患者NKG2D表达水平低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论白血病细胞表面MICA和MICB的脱落损伤基于NKG2D-MIC的抗白血病效应,可能是导致急性白血病免疫逃逸的机制之一。

急性双表型白血病的临床和实验室特征及预后分析

目的分析急性双表型白血病(BAL)的临床和实验室特征,评价急性白血病免疫双表型与治疗相关因素及临床预后的重要性。方法自2000年4月～2005年12月所有初诊的急性白血病患者400例,采用MICM分型,用流式细胞仪进行免疫表型分析,根据EGIL标准诊断BAL共30例。结果BAL占同期急性白血病(AL)7.5%,30例BAL临床表现与同期诊断为急性髓细胞白血病(AML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)患者差异无显著性(P>0.05),P170表达阳性率62%,CD34阳性率73.3%,均高于同期非BAL(P<0.05),其中B-Ly+/My+双表型18例,T-Ly+/My+双表型10例,同时表达T抗原和B抗原2例。进行20例染色体核型分析中,异常核型占11例(55%),高于同期非BAL(P<0.01),28例BAL患者接受治疗后完全缓解(CR)率为35.7%,1年总生存率为10.7%,9例兼顾粒、淋二系的方案治疗后全部CR,平均无病生存期(DFS)7个月。结论与同期非BAL相比,BAL的治疗效果较差、生存期短,与其较多的不良预后因素有关,对BAL治疗应兼顾粒、淋二系的诱导和巩固化疗方案,但长期疗效的评价有待临床进一步观察。

挽救性单倍体移植治疗幼年型粒单核细胞白血病1例

目的探讨挽救性单倍体相合造血干细胞移植治疗幼年型粒单核细胞白血病(JMML)的安全性和有效性。方法 5岁JMML患儿,采用清髓性预处理的非血缘脐血移植后植入失败,脐血移植后+36 d予以单倍体相合造血干细胞移植解救,采用减低强度预处理方案(氟达拉宾、抗人体淋巴细胞球蛋白、塞替派及低剂量的全身照射)及CSA+MMF方案预防移植物抗宿主病(GVHD)。结果脐血移植后+21 d及+28 d供受体嵌合体检测均为100%受者型,同时患者处于粒细胞缺乏及骨髓低增生状态,提示原发性移植物植入失败。半相合移植后+11 d血ANC>0.5×109/L,+60 d血小板>10×109/L,+120 d血小板>20×109/L。半相合移植后出现重度急性GVHD,给予免疫抑制剂治疗后好转,在降低免疫抑制剂过程中出现局限性慢性GVHD,至今已生存6月余,未见复发。结论减低强度的单倍体相合造血干细胞移植挽救治疗JMML安全有效。

800例骨髓细胞形态学诊断结果分析

目的探讨骨髓细胞形态学与临床血液病诊断的相关性。方法将2003~2006年该院门诊及住院部送检的800例骨髓穿刺合格标本进行细胞形态学检查与组化染色,作出实验室骨髓细胞形态学诊断。结果对骨髓细胞形态学诊断结果分析,发现骨髓细胞学诊断与临床诊断结果符合率较高的疾病分别是：缺铁性贫血（IDA）占93%,特发性血小板减少性紫癜（ITP）占91.5%,急性淋巴细胞白血病占83.2%。结论骨髓细胞形态学诊断对血液病的诊断及对原因不明疾病的诊断、鉴别诊断、疗效观察和预后判断有着非常重要价值,仍然是目前血液系统疾病诊断及鉴别诊断最便捷、最基础、最有效的手段之一。

慢性髓性白血病的治疗进展

慢性髓性白血病(CML)属于多能造血干细胞恶性骨髓增生性疾病,费城(Ph)染色体是CML的细胞遗传学标志,90%以上CML患者骨髓细胞中发现有Ph染色体,经过20年的研究,CML患者的生存愈后得到了显著改善,特别是伊马替尼研制成功给治疗CML带来了很大飞跃。这篇综述总结这些年来CML的治疗进展。

非血缘脐血移植失败行二次单倍型造血干细胞移植成功治疗骨髓增生异常综合征1例并文献复习

目的:探讨非血缘脐血移植治疗骨髓增生异常综合征失败后立即行半相合型造血干细胞二次移植作为解救方法的可能性和安全性。方法:1例骨髓增生异常综合征-难治性血细胞减少伴多系增生异常(MDS-RCMD)3年余患者,进行非血缘HLA不全相合双份脐血造血干细胞移植,移植后+30dSTR-PCR检测移植物未植入,立即予患者进行半相合造血干细胞干细胞移植以挽救患者生命。供者为患者母亲,采用"骨髓加外周血联合造血干细胞移植",预处理方案采用"抗胸腺细胞球蛋白+福达拉滨"。结果:二次移植物成功植入,形成完全供者来源的造血与免疫功能,二次移植后12dANC>0.5×109/L,+15dPLT>20×109/L,无急慢性GVHD等并发症的发生,随访19月余,患者获得长期无病生存。结论:非血缘脐血移植失败后,50d内行半相合型造血干细胞移植治疗骨髓增生异常综合征是安全、有效的挽救治疗措施。

HLA相合同胞供者异基因造血干细胞移植治疗慢性粒细胞白血病第一次慢性期的疗效观察与成本分析

目的评估HLA相合同胞供者异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）治疗慢性粒细胞白血病（CML）第一次慢性期的疗效和卫生成本。方法回顾性分析比较30例CML第一次慢性期患者行HLA相合同胞供者allo-HSCT的疗效和治疗成本。治疗成本包括移植和移植后3年内所有供受者相关费用。结果30例均获造血重建，其中8例（26．7％）发生急性移植物抗宿主病（GVHD），11例（36．7％）出现慢性GVHD，8例发生Ⅱ度-Ⅲ度迟发性出血性膀胱炎（HC），无急性HC和肝静脉闭塞病（HVOD）发生。3年生存率82．1％。计算成本效果比，allo-HSCT挽回1例死亡所耗费成本为25．4万元，相当于我国伊马替尼（格列卫，400mg／d）10个月的治疗费用。GVHD、感染和HC与移植高费用具有显著相关性（P值均〈0．01）。结论HLA相合同胞供者allo-HSCT是治疗CML第一次慢性期的有效方法。从治疗经济学角度考虑，ano-HSCT仍可作为我国有同胞全合供者的CML患者第一次慢性期的一线治疗。