弓形虫腺苷激酶基因的克隆、表达及多抗血清的制备

目的克隆弓形虫RH株腺苷激酶(AK)基因,构建原核表达载体pET28a/AK,表达AK重组蛋白,利用此重组蛋白免疫新西兰白兔制备多抗血清。方法收集、纯化弓形虫RH株速殖子,提取总RNA。设计合成的引物并引入BamHI和XhoI酶切位点,应用RT-PCR扩增弓形虫AK基因片段,目的基因插入克隆载体pGEM-T,提取重组质粒,BamHI和XhoI双酶切获得目的基因,插入原核表达质粒pET28a中,重组子双酶切、PCR和测序鉴定,转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)并以IPTG诱导表达。亲和层析法纯化重组蛋白抗原,SDS-PAGE和Western blotting验证表达量和免疫活性,免疫新西兰白兔,收集多抗血清,ELISA测定多抗滴度,Western blotting鉴定免疫活性。结果从弓形虫RH株cDNA中扩增出1 092bp的AK目标基因片段,并构建原核表达载体,诱导含pET28a/AK的宿主菌获得了高浓度、与预期分子量大小相符的表达产物,经Ni2+亲和层析法纯化获得了高纯度的rAK蛋白,Western blotting显示rAK能够被TORCH试剂盒中的Tox-IgG阳性控制血清识别,获得了纯化的重组蛋白。rAK蛋白免疫新西兰白兔,获得滴度为1∶106多价抗血清。结论成功地从弓形虫RH株基因组DNA中获取了AK基因,构建了pET28a/AK重组质粒,并获得了高效表达,免疫新西兰白兔获得了高效价多克隆抗体,为弓形虫iRNA及弓形虫病的免疫诊断奠定了基础。

实时定量PCR检测内质网应激相关基因方法的建立

从人外周血白细胞中扩增目的基因片段,构建标准品质粒,应用SYBR GreenⅠ荧光染料进行实时定量PCR,检测内质网应激相关基因的拷贝数。所建立的实时定量PCR方法在起始模板量106～1013拷贝/μl范围内,荧光信号达到阈值的循环数Ct值与模板浓度线性关系良好(R2=0.991 9),是检测内质网应激相关基因有效的手段。

IL-15在寻常型银屑病患者皮损中的表达

目的从mRNA及蛋白质水平研究白介素15(IL-15)在寻常型银屑病患者皮损及非皮损皮肤中的表达,探讨其在银屑病发病中的作用。方法采用RT-PCR和免疫组化法对28例寻常型银屑病患者皮损及非皮损皮肤中IL-15的表达情况进行了检测,同时以10例正常人皮肤作为对照。结果2种IL-15前体蛋白的mRNA在所有皮肤标本中都有表达,银屑病皮损中IL-15mRNA的表达明显高于非皮损处皮肤(P<0.001)和正常人皮肤(P<0.001),非皮损皮肤的表达与正常人皮肤相比差异无显著性(P>0.05)。免疫组化结果显示:IL-15低表达于非皮损和正常皮肤的基底细胞层,而在银屑病皮损处高表达,且表达范围可达表皮全层及真皮乳头层。皮损处IL-15的表达明显高于非皮损(P<0.001)和正常皮肤(P<0.001),非皮损与正常皮肤之间的表达无显著性差异(P>0.05)。结论寻常型银屑病的皮损中高表达IL-15,在疾病的发生中可能起一定的作用。

肌球蛋白重链Ⅱ和α-平滑肌肌动蛋白在成年犬咽-食管肌层的表达

目的：研究健康成年毕克犬咽和食管肌层肌球蛋白重链Ⅱ（MHC-Ⅱ）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达及其空间分布.方法：采用免疫组织化学SP法对6例健康成年毕克犬咽-食管肌层MHC-Ⅱ、α-SMA的表达进行观察.结果：MHC-Ⅱ在咽部和食管上端至近贲门部肌层均有表达;α-SMA在食管中段下份内肌层最内侧开始有少量表达,至近贲门部食管肌层其表达逐渐增强,由内肌层最内侧扩展至外肌层.结论：与人类不同,成年毕克犬咽和食管上端至近贲门部肌层均有MHC-Ⅱ表达,其表达强度由上而下呈渐进性减弱;成年毕克犬咽和食管肌层α-SMA主要表达在食管中段下份和食管下段,其表达强度自食管中段下份至近贲门部呈渐进性加强.

c—kit阳性细胞和胎儿食管平滑肌发育的关系

目的：探讨c-kit阳性细胞和旷平滑肌肌动蛋白阳性平滑肌细胞（a-SMA）在人胎儿食管中分布关系。方法：采用免疫荧光组织化学双重标记法对8例胎儿食管中c—kit阳性细胞和a-SMA阳性平滑肌细胞的分布进行观察。结果：c-kit阳性细胞在食管上段内肌层内侧有少量分布，肌间层和黏膜下层也可见零星分布，在食管中段外肌层开始有少量分布，内肌层数量中等，至食管下段内外肌层均有大量分布。a-SMA阳性平滑肌细胞在食管肌层由上至下逐渐增加，并由内肌层扩展到外肌层。在食管上端肌问层和黏膜下层可见少量c—kit和a—SMA共同表达。结论：c—kit阳性细胞可能是Cajal问质细胞，在胎儿食管的分布与平滑肌密切相关。食管内平滑肌细胞和Cajal间质细胞可能起源于同一种前体细胞。

复方芪参提取物对瘢痕疙瘩成纤维细胞内Smad蛋白连接区的影响

目的研究复方芪参提取物(CASE)对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFs)内Smad蛋白连接区的影响。方法 MTT法检测CASE对新生牛血清(NBS)诱导的KFs增殖的影响;细胞免疫荧光染色法观察不同浓度(7.5、15、30mg/L)CASE对TGF-β1诱导的KFs内Smad2L和Smad3L蛋白磷酸化的影响;人体正常成纤维细胞(NFs)作为对照。结果 CASE(15、30、60mg/L)能够显著抑制NBS诱导的KFs的增殖,其IC50为18.90mg/L;TGF-β1能够诱导KFs内Smad2L和Smad3L蛋白磷酸化,而CASE(7.5、15、30mg/L)对这两种蛋白的磷酸化均具有明显的抑制作用,而TGF-β1对NFs中Smad2L和Smad3L蛋白表达无明显影响。结论 CASE能够抑制KFs细胞的增殖,其作用机制可能与抑制Smad2连接区和Smad3连接区磷酸化有关。

潘顿-瓦伦丁杀白细胞毒素lukF-PV基因的克隆及原核表达

潘顿-瓦伦丁杀白细胞毒素（PVL）是金黄色葡萄球菌所产生的一种毒素蛋白，由lukF-PV和lukS．PV蛋白组成，编码基因分别为lukF-PV和lukS-PV，双组分在PML形成聚合体，通过细胞打孔机制引发白细胞裂解和凋亡。PVL近年来在世界范围内呈上升趋势，1999年美国CDC报道4例儿童患者死于PVL阳性的金黄色葡萄球菌引起的脓毒症，其中3例合并坏死性肺炎和（或）脓胸，由此引起临床高度重视。

血吸虫感染对超敏性疾病与自身免疫性疾病的调控作用

近年来，与发展中国家相比，超敏反应性疾病与自身免疫性疾病的发病率在发达国家较高，并有上升趋势。随着卫生假说（hygiene hypothesis）的提出，许多学者进行了相关研究来试图解释这个假说。一些学者在研究血吸虫感染与超敏反应性疾病及自身免疫性疾病的关系时发现了相关机制，并促使了对该假说的进一步研究。