紫杉醇水凝胶成胶因子延缓微管蛋白聚集

紫杉醇是最有效的抗癌药物之一，其机理主要是通过与序一微倚蛋白结合，抑制微管解聚．我们前期工作表明，紫杉醇的水凝胶成胶因子Fmoc—Phe—Phe—Lys（PTx）-Tyr（H2PO3）-OH能够促进神经元分支化，但其机理不详．本文通过微管蛋白体外组装一解组装实验，发现化合物Fmoc—Phe—Phe—Lys（PTx）-Tyr（H2PO3）-OH（1）比紫杉醇有着更明显的延缓微管蛋白聚集的作用．化合物1在碱性磷酸酶的作用下形成Fmoc—Phe—Phe—Lys（PTx）-Tyr-OH纳米纤维，其直径与微管蛋白二聚体的尺寸相当．由此推测这种纳米纤维不仅抑制了微管蛋白二聚体的相互聚集，而且干扰了微管正端微管蛋白的聚集．本：工作提供了一个紫杉醇衍生物成胶因子抑制微管聚集的新原理．

p100^(Rb)和p80^(Rb)过表达对细胞周期和凋亡的影响

目的探究视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)截短体p100^(Rb)和p80^(Rb)对细胞周期、凋亡的影响。方法构建pcDNA3.1-p100^(Rb)-FLAG、pcDNA3.1-p80^(Rb)-FLAG真核表达质粒;分别转染至U2OS细胞中,进行免疫荧光制片,检测p100^(Rb)和p80^(Rb)细胞定位情况;将pcDNA3.1-RB1-FLAG、p100^(Rb)和p80^(Rb)分别转染至HEK 293T细胞中,提取总蛋白进行免疫印迹,检测Rb、p100^(Rb)和p80^(Rb)的过表达;过表达Rb、p100^(Rb)和p80^(Rb)后利用流式细胞术检测细胞周期、凋亡。结果成功构建pcDNA3.1-p100^(Rb)-FLAG和pcDNA3.1-p80^(Rb)-FLAG真核表达质粒;在U2OS细胞中p100^(Rb)主要定位在细胞核,p80^(Rb)主要定位在细胞质;Rb、p100^(Rb)和p80^(Rb)在HEK 293T细胞中可过表达;过表达Rb、p80^(Rb)和p100^(Rb)后,与对照组比较,过表达的Rb实验组和p100^(Rb)实验组细胞周期G 1期百分比升高,各实验组细胞的凋亡率均显著降低(均P<0.05)。结论过表达p100^(Rb)可抑制HEK 293T细胞凋亡且阻滞细胞周期;过表达p80^(Rb)可抑制HEK 293T细胞凋亡但对细胞周期无影响。

5-磷酸核糖醇转移酶fukutin抑制HeLa细胞中α-dystroglycan的分泌

目的探究5-磷酸核糖醇转移酶fukutin(FKTN)对HeLa细胞周期、凋亡、迁移以及α抗肌萎缩相关糖蛋白(α-DG)分泌的影响。方法构建质粒pcDNA3.1-α-DAG-HA,将pcDNA3.1-FKTN-3xFlag转染至HeLa细胞,提取总蛋白,Western blot法检测FKTN的过表达;过表达FKTN后利用流式细胞术检测细胞周期、凋亡情况;过表达FKTN后,采用细胞划痕实验检测细胞迁移速率,使用麦胚凝集素琼脂糖珠(WGA-agarose)富集培养液中的α-DG,然后进行Western blot检测。结果成功构建pcDNA3.1-α-DAG-HA真核表达质粒;FKTN在HeLa细胞中可过表达;过表达FKTN后与对照组相比,实验组细胞周期S期百分比下降(P<0.001),细胞凋亡率无变化(P>0.05);过表达FKTN后与对照组相比,实验组细胞迁移速率无变化(P>0.05),α-DG分泌量减少。结论过表达FKTN阻滞HeLa细胞周期,抑制α-DG分泌,但对细胞凋亡、迁移无影响。

RACK1与CLIC1的相互作用鉴定

目的探究胞内氯离子通道蛋白1(CLIC1)与活化蛋白激酶C受体1(RACK1)在细胞内的相互作用。方法构建重组质粒pcDNA3.1-RACK1-HA,转染质粒pcDNA3.1-RACK1-HA和(或)pcDNA3.1-CLIC1-FLAG到HEK 293T细胞中,转染pcDNA3.1-RACK1-HA和(或)pcDNA3.1-CLIC1-FLAG到COS7中。GST-pulldown和免疫共沉淀实验确定CLIC1和RACK1在体内及体外的相互作用。间接免疫荧光实验检测RACK1与CLIC1在细胞中的定位。结果成功构建pcDNA3.1-RACK1-HA,Western blot检测结果证明了RACK1和CLIC1可在HEK 293T细胞中表达,GST-pulldown结果显示RACK1与CLIC1在体外可直接结合,免疫共沉淀结果显示RACK1和CLIC1可在细胞内结合。间接免疫荧光实验表明RACK1与CLIC1可共定位于细胞质。结论RACK1与CLIC1可在细胞中结合。