提高医学生物化学教学质量策略探讨

医学生物化学对于医学院学生而言是一门非常重要的基础学科,但是由于该学科的课程特点使得学生对生物化学的学习具有畏惧心理,如课程内容多、知识结构复杂以及不易记忆等特点。怎样有效的提高医学生物化学教学效果是一个值得关注的问题,笔者根据自己多年的医学院医学生物化学的教学经验提出几点相应的对策。

镧元素生物效应研究进展

对稀土元素镧的生理效应、毒副作用及其作用机理研究概况作了较为具体的论述,旨在为未来稀土生物学效应研究和开发应用提供基础研究资料。分析表明:低浓度镧对乳牙人工釉质龋有再矿化作用,对口腔内细菌也有抑制作用;对胃粘膜有一定的保护作用;适宜浓度的镧有明显的抗细胞突变作用;同时,还对内分泌功能、免疫功能也有一定促进作用。另外,镧元素具有一定的毒副作用,主要表现在一定剂量的镧可诱导染色体畸变以及镧对大脑功能和神经系统以及肝脏、心脏、肾脏等器官的影响。

Sigirr缺失调控NF-κB并参与慢性肾病小鼠发生肾间质纤维化

目的研究Sigirr基因缺失小鼠在慢性肾病(CKD)并发肾间质纤维化(RIF)中的作用和机制。方法利用PCR鉴定正常基因型(Sigirr^(+/+))小鼠和Sigirr基因缺失(Sigirr^(-/-))小鼠。含0.2%高腺嘌呤饲料喂养小鼠,连续喂养12周,以建立慢性肾脏损伤并发RIF模型。收集小鼠眼框静脉血以检测肾功能;利用HE染色分析肾脏组织病理变化,通过Masson染色观察肾脏纤维化程度,利用IHC和Western blot检测白细胞介素(IL)-1β、MyD88和NF-κB等信号分子变化,同时观察转化生长因子(TGF)-β1、E-cadherin和Vimentin的表达变化。结果肾功能检测结果显示高腺嘌呤喂养小鼠的血清肌酐和尿素氮较对照组增加;HE和Masson染色结果显示:与Sigirr^(+/+)小鼠比较,Sigirr^(-/-)小鼠的肾组织中,炎症细胞浸润和胶原纤维沉积更明显。IHC和Western blot结果显示IL-1β及其下游的MyD88表达增加,p-P65水平显著增加;Sigirr^(-/-)小鼠的肾组织中IL-1β、MyD88、p-P65等变化较Sigirr^(+/+)小鼠显著;同时TGF-β1显著增加,且Vimentin的表达增加,E-cadherin的表达明显降低,Western blot检测Vimentin、E-cadherin结果与免疫组化一致,且α-SMA也显著升高。结论高腺嘌呤饮食可以建立CKD并发RIF小鼠模型。Sigirr的缺失增加肾间质IL-1β介导NF-κB信号通路的活化,促进TGF-β1表达,有利于上皮-间质细胞转分化相关RIF过程。

基于CRISPR/Cas9系统建立GPR108缺失的THP-1细胞株及其功能初步研究

目的建立稳定敲除G蛋白偶联受体108(GPR108)基因的人单核细胞白血病细胞系(THP-1),并初步研究其功能。方法根据人GPR108基因序列设计,合成可应用于成簇有规律的间隔短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)的单链引导RNA(sgRNA1和sgRNA2)对应的DNA,利用分子克隆技术在pL-CRISPR.EFS.GFP慢病毒载体中插入sgRNA1和sgRNA2序列,构建重组载体(pL-CRISPR.EFS.GFP-sgRNA1和pL-CRISPR.EFS.GFP-sgRNA2)。将测序正确的重组体与包装质粒(pMD2.G和psPAX2)共转染293T细胞进行病毒包装,收集病毒液并感染THP-1细胞。利用流式细胞分选技术分离GFP+细胞于96孔培养板中,培养获得单细胞克隆。利用聚合酶链式反应(PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测THP-1细胞中GPR108是否敲除成功。应用脂多糖(LPS)刺激GPR108-/-和GPR108+/+的THP-1细胞,Western blot法检测细胞内白细胞介素-8(IL-8)的表达,流式微球技术(CBA)检测细胞培养上清液中的IL-8浓度。结果成功构建重组慢病毒载体pL-CRISPR.EFS.GFP-sgRNA,转染THP-1细胞后通过流式细胞仪分选获得单细胞克隆F9。PCR和Western blot法均证实F9是GPR108-/-THP-1单细胞克隆。LPS刺激GPR108-/-和GPR108+/+THP-1细胞,Western blot和CBA的结果均显示敲除GPR108的THP-1细胞中IL-8的合成和分泌明显减少。结论成功建立GPR108缺失的THP-1细胞株;缺失GPR108的THP-1细胞在受到LPS刺激时产生的趋化因子IL-8显著降低。为后续研究GPR108在免疫炎症中的作用奠定了基础。

妊娠期糖尿病患者脂肪细胞因子与炎症的相关性分析

目的探讨妊娠糖尿病(GDM)患者脂肪细胞因子瘦素、视黄醇结合蛋白4(RBP4)、脂联素与炎症细胞因子白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的关系。方法选择GDM患者60例,正常糖耐量(NGT)孕妇44例,根据体重和身高计算晚孕期体重指数(BMI);检测空腹血糖(FBG)水平,计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)和胰岛素敏感指数(ISI);酶法检测血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC);比色法测定游离脂肪酸(FFA)水平;ELISA法检测所有孕妇血清中脂联素和RBP4水平;放射免疫法检测空腹胰岛素(FIns)、瘦素、IL-6、TNF-α水平。将两组孕妇的各指标之间进行Pearson相关分析。结果与NGT组比较,GDM组的FPG、TG、TC、FFA、瘦素、IL-6、TNF-α、RBP4水平均明显升高,脂联素水平明显下降,存在显著的炎性激活及胰岛素抵抗;HO-MA-IR、RBP4、瘦素与IL-6、TNF-α呈正相关;ISI、脂联素与IL-6、TNF-α呈负相关。结论 GDM患者由于过度分泌的脂肪细胞因子和炎性因子导致显著的炎性激活,可能是GDM中胰岛素抵抗发生发展的机制之一。

白藜芦醇改善高脂血症小鼠脂肪组织胰岛素抵抗的机制探讨

目的探讨白藜芦醇对高脂血症小鼠2种白色脂肪组织胰岛素抵抗相关基因瘦素(Leptin)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和葡萄糖调节蛋白78(GRP78)表达的影响。方法24只雄性C57BL/6小鼠随机分为标准饮食组(SCD)、高热量高胆固醇饮食组(HCD)及高热量高胆固醇饮食+白藜芦醇组[HCD+RES,白藜芦醇400 mg/(kg·d),12周]。葡萄糖耐量实验和胰岛素耐量实验分析胰岛素抵抗的改善作用,检测血脂指标,称取皮下脂肪(SAT)和肾周脂肪组织(VAT)重量,HE染色检测脂肪组织的病理学变化,免疫组化和实时荧光定量PCR分析Leptin、TNF-α、GRP78的胞内分布和基因表达的改变。结果 HCD组小鼠出现明显的胰岛素抵抗,血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白C(LDL-C)显著增高,高密度脂蛋白C(HDL-C)明显降低,体重、SAT、VAT的重量均明显增加,脂肪细胞体积明显增大,Leptin、TNF-α、GRP78的mRNA和蛋白表达显著增加,且均位于胞质中;白藜芦醇能显著改善胰岛素抵抗,明显降低体重和逆转血脂水平变化,明显下调SAT和VAT中Leptin、TNF-α、GRP78的蛋白表达和分布,显著降低SAT中Leptin、TNF-α、GRP78和VAT中Leptin、TNF-αmRNA的表达。结论白藜芦醇具有明显的改善胰岛素抵抗和降脂作用,其机制可能是通过抗炎、减少Leptin表达和内质网(ER)应激有关,但对不同部位白色脂肪组织基因表达的影响差异不大。

利拉鲁肽诱导肥胖2型糖尿病大鼠白色脂肪组织中FGF21的表达及机制

目的 探讨利拉鲁肽(liraglutide,LRG)对肥胖2型糖尿病大鼠白色脂肪组织(white adipose tissue,WAT)中成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor 21,FGF21)表达的影响及机制。方法 ♂SD大鼠,随机分为对照组、2型糖尿病组(DM)及2型糖尿病+利拉鲁肽组(DM+LRG),后两组先给予高脂饮食,然后腹腔注射30 mg·kg^(-1)链脲佐菌素构建肥胖2型糖尿病模型,DM+LRG组再腹腔注射利拉鲁肽0.4 mg·kg^(-1)·d^(-1),每天2次,干预6周。检测血液生化指标以及FGF21水平,HE染色检测附睾脂肪组织的形态学变化,免疫组化、RT-PCR和免疫印迹法检测WAT中FGF21、PPARγ、FGFR3、β-Klotho、LKB1、AMPK、ACC的mRNA、蛋白表达与磷酸化及MAPK信号分子的磷酸化水平。结果 DM组大鼠体重和血脂、ALT、AST增高,FGF21降低,附睾脂肪细胞体积增大,FGF21、PPARγ、p-FGFR3、β-Klotho、p-LKB1、p-AMPK、p-ACC的表达降低,p-ERK、p-JNK、p-p38的表达均升高;DM+LRG组上述各指标均逆转。结论 利拉鲁肽具有明显的降脂作用,其机制可能与增加脂肪组织中FGF21的表达,进而激活AMPK信号通路和抑制MAPK通路有关。

白藜芦醇通过减缓内质网应激及增加eNOS的表达改善高热量高胆固醇饮食引起的内皮损伤

目的探讨白藜芦醇改善高热量高胆固醇饮食引起的血管内皮损伤的机制是否与内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)及内皮型一氧化氮合酶(e NOS)表达的改变有关。方法将24只♂C57BL/6小鼠随机分为标准饮食组(SCD)、高热量高胆固醇饮食组(HCD)及高热量高胆固醇饮食+白藜芦醇组(HCD+RES,白藜芦醇,400 mg·kg-1·d-1),共12周。观察胸主动脉内皮的病理学变化,检测eNOS的表达和ERS上下游相关基因的表达。将血管内皮细胞(MAEC)分为正常对照组(NC组)、模型组(棕榈酸组,PA)、中浓度RES药物对照组(RES)、低中高剂量RES治疗组(RES dose+PA),观察其对棕榈酸(PA)诱导的小鼠MAEC增殖的影响,检测葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、转录因子GADD153(CHOP)蛋白和eNOS蛋白的表达。结果与SCD组相比,HCD组小鼠胸主动脉管壁明显增厚,弹力纤维排列紊乱,ERS上下游基因表达明显升高(P<0.05),eN OS蛋白表达减少;与HCD组相比,HCD+RES组血管弹力纤维排列明显改善,ERS相关基因的表达水平明显降低(P<0.05),eNOS蛋白表达增加。与NC组相比,PA组细胞增殖明显减少(P<0.05),GRP78和CHOP表达明显增加(P<0.05),eNOS表达降低,中、高剂量RES干预后MAECs增殖明显增强(P<0.05),GRP78和CHOP表达明显减少(P<0.05),eNOS蛋白表达增加。结论白藜芦醇有明显的改善高脂饮食引起的内皮损伤和PA诱导的抑制内皮细胞增殖作用,可能与其减缓ERS、增加eNOS的表达有关。

p16基因甲基化特异检测方法的建立及其初步应用

目的 建立 p16基因中CpG岛的甲基化分析方法 ,即甲基化特异的PCR(methylation specificpolymerasechainreaction ,MSP)方法及其初步应用。方法 用亚硫酸氢钠修饰变性后的被测DNA ,随之进行甲基化、非甲基化特异的PCR扩增。应用MSP法分析白血病患者的白细胞 p16基因5′CpG岛的甲基化变异情况。结果 用加热法变性DNA ,亚硫酸氢盐修饰DNA ,WizardDNA纯化树脂除盐、纯化修饰后的DNA都获得了成功 ,并建立了MSP分析p16基因甲基化的方法。白血病患者的白细胞 p16基因的 5′CpG岛有一定比例的甲基化变异。结论 MSP是一种较为简便。

一种拟青霉代谢产物提取物对慢性应激抑郁大鼠血CORT、ACTH含量及下丘脑CRH mRNA表达的影响

目的：研究一种拟青霉代谢产物提取物(bioactive compounds from paecilomyces tenuipes，BCPT)对慢性应激抑郁大鼠血皮质酮(CORT)、促肾上腺皮质激素(ACTH)含量及下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)mRNA表达的影响。方法：在慢性温和性不可预见性应激(CUMS)模型上，采用糖水消耗量法观测动物的奖赏反应；以放射免疫分析方法(RIA)测定血清CORT及血浆ACTH含量；利用半定量逆转录．聚合酶链反应(RT-PCR)方法，测定下丘脑CRHmRNA的表达。结果：BCPT 40、80 mg·kg^(-1)可不同程度增加模型大鼠糖水消耗量，改善模型大鼠的奖赏反应，并能不同程度降低模型大鼠血清CORT、血浆ACTH含量；下调慢性应激大鼠下丘脑CRHmRNA的过度表达。结论：BCPT的抗抑郁作用可能与其改善慢性应激大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPAA)功能亢进有关。

丹蛭降糖胶囊治疗肥胖引起的慢性肾病的机制研究

目的探究丹蛭降糖胶囊(DJC)改善肥胖引起的大鼠慢性肾病的初步机制。方法♂SD大鼠随机分为基础饲料组(CON)、高脂饲料组(HFD)、高脂饲料+丹蛭降糖胶囊低剂量组(HFD+DJCL,500 mg·kg^(-1)·d^(-1))、高脂饲料+丹蛭降糖胶囊高剂量组(HFD+DJCH,1 000 mg·kg^(-1)·d^(-1)),除CON组外,均给予高脂饮食12周,治疗组再灌胃治疗8周。检测血清血脂和肾代谢指标,HE、油红O、PAS染色观察肾脏的病理学变化,10%肾匀浆测定肾组织TG、TSOD、Cu Zn-SOD、CAT、GSH-Px、TNOS、MDA含量,免疫组化法检测CD36的表达变化,RT-PCR分析SREBP1c及FASN的表达,Western blot分析DJC对AMPK、磷酸化AMPK、PPARα、PPARγ表达的影响。结果对比CON组,HFD组大鼠体质量增加,血清TC、TG、UA、BUN、Scr升高,HDL-C下降,肾小球出现明显的损伤及脂质沉积,GSH-Px、MDA升高,TSOD、CAT、Cu Zn-SOD、TNOS水平降低,CD36、SREBP1c、FASN、PPARγ的表达上升,PPARα、AMPK、磷酸化AMPK表达下降;对比HFD组,HFD+DJCL和HFD+DJCH组均明显逆转上述指标,且有一定的剂量效应。结论 DJC可有效降低高脂饮食引起的肾内脂质沉积和氧化应激水平,其机制可能是通过激活AMPK-PPARα通路,抑制CD36和脂肪生成基因PPARγ、SREBP1c、FASN的表达,并有一定的剂量效应。

弓形虫ROP18重组腺病毒载体的构建及其对神经干细胞C17.2凋亡的影响

目的构建弓形虫棒状体蛋白ROP18重组腺病毒载体,研究其对神经干细胞C17.2凋亡的影响。方法将弓形虫ROP18从PEGFP-G2-ROP18重组质粒上亚克隆至腺病毒载体pHBAd-MCMV-GFP,重组腺病毒载体pHBAd-MCMVGFP-ROP18经PCR、测序鉴定正确后,与骨架质粒pHBAd-BHG共转染HEK293细胞进行包装,收获、扩增重组腺病毒并对其滴度进行测定。以MOI=70的重组腺病毒感染神经干细胞C17.2,转染不同时间荧光显微镜观察基因的表达情况。转染48h用CCK-8法检测C17.2的增殖情况;转染24h采用Annexin V-APC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡情况;Western blot法检测半胱天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)的蛋白水平。结果重组ROP18过表达腺病毒在C17.2神经干细胞内能有效表达。转染48h,与空载体对照组相比,C17.2细胞增殖活性明显降低(P<0.05);转染24h,流式细胞术检测结果显示,ROP18基因转染组C17.2细胞凋亡率明显增加(P<0.001);Western blot检测显示caspase-3活性片段的表达明显增加(P<0.05)。结论成功构建了弓形虫ROP18重组腺病毒并在神经干细胞C17.2中表达,ROP18重组腺病毒能诱导C17.2神经干细胞凋亡。

乙型肝炎病毒前C区1896位点突变的PCR分析法

目的分析乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）前Ｃ区突变与ＨＢＶ感染患者肝脏病变的关系，建立ＨＢＶ前Ｃ区１８９６位点突变的ＰＣＲ分析方法。方法根据ＨＢＶ前Ｃ区ＤＮＡ序列，采用３′－碱基特异性聚合酶链反应分析ＨＢＶ第１８９６位核苷酸的突变，并检测了１２６例临床血清标本。结果成功分析了ＨＢＶ前Ｃ区１８９６位点突变，１２６例临床标本突变株检出率为４７．２％。结论本法操作简单，重复性好。

重组人PTP1B的原核高效表达及TFLC的体外抑制剂实验

目的高效诱导表达并纯化具有活性的重组PTP1B融合蛋白(rhPTP1B),进行酶活性及抑制剂的实验。方法重组体pGEX-hPTP1B转化E.coliDH5α,诱导表达rhPTP1B并优化条件后,超声取细胞裂解上清液经GST亲和层析柱纯化后,利用rhPTP1B水解特异性底物4-硝基苯基磷酸二钠盐(pNPP-Na2)的磷酸基团而产生颜色反应来测定rhPTP1B活性,并分析其与rhPTP1B浓度、底物浓度及反应温度的关系,钒酸钠(Na3VO4)抑制类型的研究,老鹰茶总黄酮(TFLC)对rhPTP1B的抑制性作用和浓度依赖关系。结果rhPTP1B表达的最适条件是在34℃和2.0mmol/LIPTG下诱导表达10h,可被GST亲和层析法分离纯化;其活性随酶浓度及底物浓度的增加而增加,35℃时rhPTP1B的活性最大;钒酸钠的作用机制可能为非竞争性抑制作用;TFLC对rhPTP1B有明显的抑制作用。结论诱导表达纯化的rhPTP1B融合蛋白可用于抑制剂的研究,TFLC对rhPTP1B的强抑制作用可能是其降低糖尿病大鼠血糖浓度的机制之一。

非诺贝特保护非酒精性脂肪性肝病小鼠胰岛素抵抗作用机制的探讨

目的研究非诺贝特改善非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)小鼠的胰岛素抵抗是否与内质网应激(ERS)有关。方法采用高热量高胆固醇饮食(HCD)建立NAFLD小鼠模型,非诺贝特40 mg/(kg·d)灌胃治疗2周,葡萄糖耐量试验(GTT)和胰岛素耐量试验(ITT)分析胰岛素抵抗的改善作用,检测血清血脂和丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)指标,HE及油红O染色观察肝脏组织的病理学变化,Real-time PCR和Western blot法检测过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)、ERS标志物葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和转录因子GADD153(CHOP)的表达。结果与正常饮食(SCD)组相比,HCD组小鼠胰岛素抵抗明显,血清三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)显著升高(P<0.01,P<0.05),高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)明显降低(P<0.01),肝细胞内有大小不等的脂滴形成,可见气球样变的肝细胞及炎性细胞浸润;PPARα、GRP78 mRNA及蛋白表达显著降低,CHOP mRNA及蛋白表达显著升高。与HCD组相比,HCD+非诺贝特(HCF)组小鼠血清TG明显降低(P<0.05),肝细胞脂滴含量、变性肝细胞及浸润的炎细胞明显减少,PPARα、GRP78mRNA及蛋白表达明显升高,CHOP mRNA及蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论非诺贝特有明显的改善NAFLD小鼠胰岛素抵抗、降低TG的作用,这可能与激活PPARα及减轻ERS有关。

辛伐他汀对高糖诱导的血管内皮细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨辛伐他汀(SIM)对高糖诱导的血管内皮细胞(VEC)增殖及凋亡的影响,及其对VEC保护的作用机制。方法将处于对数生长期的VEC随机分为正常对照组(Glu 5.5 mmol/L)、高糖组(Glu 33 mmol/L)、高糖+3个不同浓度SIM组,MTT法检测VEC增殖的变化,试剂盒检测细胞上清液中一氧化氮(NO)和内皮素(ET-1)的水平,流式细胞术检测各组细胞活性氧(ROS)的水平和凋亡率;增加高糖+SP600125组(SP600125 10.0μmol/L),Western blot法检测JNK蛋白表达和磷酸化水平。结果与正常对照组相比,高糖组细胞上清中NO水平明显下降、ET-1水平明显上升、ROS含量和凋亡率明显增加、JNK磷酸化水平明显上调。JNK抑制剂SP600125预处理后,VEC的p-JNK表达显著减少。SIM可显著逆转上述高糖效应,且呈一定的浓度依赖性。结论 SIM对VEC的保护作用可能与其促进细胞增殖、减少氧化应激和细胞凋亡、降低JNK的磷酸化水平有关。

急性淋巴细胞白血病p16基因纯合性缺失、点突变及启动子甲基化变异

目的 探讨急性淋巴细胞白血病(ALL)患者p16基因的失活机制。方法 从29例患者外周血提取白细胞基因组DNA,采用PCR、PCR SSCP、MSP分析方法,对p16基因第二外显子的纯合性缺失、点突变及启动子区CpG岛的甲基化变异进行分析。结果 p16基因第二外显子的缺失率为27. 6% (8 /29),未见其点突变;p16基因启动子区CpG岛的甲基化率为13. 8% (4 /29)。结论 p16基因的失活和ALL的发生发展有一定的关系。