GRA15_(Ⅱ)在小鼠肿瘤微环境中促进巨噬细胞极化抗肝癌

肿瘤相关巨噬细胞(TAM)与肿瘤的转归密切相关,探索刚地弓形虫致密颗粒蛋白分子(GRA15_(Ⅱ))在肿瘤微环境中通过诱导巨噬细胞(Mφ)极化抑制肿瘤生长的作用机制。通过构建肝细胞癌小鼠,注射LV-gra15_(Ⅱ)重组慢病毒后,采用实时荧光定量PCR、酶联免疫法、免疫组化、流式细胞术和共聚焦显微镜分析肿瘤微环境中的免疫应答情况。结果显示,GRA15_(Ⅱ)可在体外诱导M2样Mφ向M1表型偏移。而且,在荷瘤小鼠注射LV-gra15_(Ⅱ)后,肿瘤体积明显减小,进一步分析发现,在肿瘤微环境中GRA15_(Ⅱ)主要通过TRAF6途径激活NF-κB,诱导TAM从M2向M1偏移,且NO、IL-12、TNF-α的表达上调,发挥Th1免疫应答。GRA15_(Ⅱ)能够抑制肿瘤生长,此研究为肿瘤免疫治疗提供新的思路和策略,为开发新的药物提供实验室基础。

某院2019—2020年住院患者传染性疾病病原体血清标志物检测结果分析

目的了解住院患者4项传染性疾病病原体血清标志物[乙肝表面抗原(HBsAg)、丙肝病毒抗体(抗-HCV)、人类免疫缺陷病毒抗体(抗-HIV)1/2和梅毒螺旋体抗体(抗-TP)]的检测结果,为感染性疾病的预防控制提供依据。方法采用化学发光法对2019年8月至2020年6月安徽中医药大学第一附属医院收治的510例住院患者进行HBsAg、抗-HCV、抗-TP和抗-HIV1/2检测,分析4项病原体血清标志物的阳性率分布,比较不同性别、年龄患者4项病原体血清标志物的阳性率分布,分析HBsAg阳性患者的感染模式。结果510例住院患者中,病原体血清标志物阳性的患者有37例,总阳性率为7.25%,其中HBsAg、抗-HCV、抗-TP和抗-HIV1/2的阳性率分别为6.47%、0.59%、0.39%和0.00%。男、女患者病原体血清标志物总阳性率分别为10.81%和4.51%,差异有统计学意义(P<0.05)。年龄<30岁、30~60岁和>60岁患者病原体血清标志物的总阳性率分别为4.29%、9.02%及7.41%,差异无统计学意义(P>0.05)。HBsAg阳性患者的感染模式以“小三阳”为主,占76.92%,“大三阳”占11.54%。结论住院患者入院时进行HBsAg、抗-HCV、抗-TP和抗-HIV1/2检测有助于了解患者的感染状况,便于医护人员采取针对性的治疗和防范措施,对预防医院感染和职业暴露具有重要意义。

去铁酮对弓形虫慢性感染小鼠肝损伤中铁代谢紊乱的治疗作用

目的观察弓形虫慢性感染小鼠服用去铁酮(DFP)后,肝脏中铁及其他金属元素和炎症因子γ干扰素(IFN-γ)的变化情况,探讨DFP治疗弓形虫慢性感染所致肝损伤的疗效。方法将6周龄的雌性C57BL/6小鼠随机分为4组:control组、control+DFP组、TgCtWh6组、TgCtWh6+DFP组,每组6只,control组无菌灌胃PBS;TgCtWh6+DFP组每日灌胃50μg/kg DFP,TgCtWh6组灌胃20个弓形虫包囊,TgCtWh6+DFP组灌胃20个弓形虫包囊且每日灌胃50μg/kg DFP,饲养45 d后处死小鼠并取其肝脏组织。采用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)检测小鼠肝脏组织中铁及其他金属元素含量;采用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)和Western blot分别检测小鼠肝脏组织中IFN-γ、铁蛋白重链(Fth)mRNA的表达水平和蛋白水平。结果慢性弓形虫感染的小鼠肝脏中铁、锰和锌的组织留存水平增高,在服用DFP后其肝脏中铁元素含量明显下调(P<0.01),与TgCtWh6组相比,TgCtWh6+DFP组在服用DFP后肝脏中Fth含量下调(P<0.01),铁代谢紊乱得到了有效改善,同时肝脏中IFN-γ含量明显下调(P<0.01),肝脏的炎症反应也有所减轻。结论DFP可以有效改善小鼠弓形虫感染后肝脏中的铁代谢紊乱及减轻肝脏的炎症性损伤。

我国弓形虫Chinese 1优势基因型感染对小鼠组织中微量金属元素代谢的影响

目的观察弓形虫Chinese 1优势基因型(ToxoDB#9)弱毒株TgCtwh6感染小鼠后,其体内微量金属元素的留存情况,探讨TgCtwh6感染对小鼠各组织金属元素代谢的影响。方法建立TgCtwh6感染小鼠急性期模型(急性期组)和慢性期模型(慢性期组),同时设置对照组,实验小鼠6只/组。运用电感耦合等离子体质谱仪检测不同组别小鼠心脏、肝脏、脾脏和肾脏内的Fe^(2+)、Cu^(2+)、Mn^(2+)、Zn^(2+)、Mg^(2+)等金属元素水平,Western blot检测不同组别小鼠肝脏内金属元素转运体ZIP 8(Zrt-and Irt-like protein 8)的蛋白表达,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性检测试剂盒检测SOD活性,对不同组别的检测结果进行统计分析。结果相对于对照组,急性期组和慢性期组小鼠肝脏内Fe^(2+)、Mn^(2+)和Zn^(2+)含量均上调[(76.348±11.613)μg/g和(88.545±10.555)μg/g vs.(52.388±6.165)μg/g;(1.298±0.065)μg/g和(1.405±0.066)μg/g vs.(1.141±0.110)μg/g;(17.506±0.824)μg/g和(17.031±0.907)μg/g vs.(15.650±0.305)μg/g];脾脏内Fe^(2+)、心脏内Cu^(2+)和Zn^(2+)含量均下调[(128.519±13.531)μg/g和(120.309±10.023)μg/g vs.(147.720±15.303)μg/g;(5.189±0.255)μg/g和(5.631±0.485)μg/g vs.(6.440±0.740)μg/g;(17.034±0.974)μg/g和(16.858±0.953)μg/g vs.(19.258±0.965)μg/g]。急性期组小鼠心脏内Mn^(2+)和Mg^(2+)含量均低于对照组[(0.605±0.052)μg/g vs.(0.686±0.051)μg/g;(153.346±3.221)μg/g vs.(163.012±8.204)μg/g]。与对照组相比,急性期组和慢性期组小鼠肝脏ZIP 8蛋白表达均上调,且慢性期组高于急性期组(F=35.240,P<0.05)。对照组、急性期组和慢性期组小鼠肝脏SOD活性分别为(14.041±0.734)U/mL、(16.463±0.616)U/mL和(15.859±0.780)U/mL,组间差异有统计学意义(F=9.370,P<0.05)。结论TgCtwh6急性和慢性感染状态下小鼠不同组织中部分微量金属元素含量会发生上调或者下调,同时出现ZIP 8表达上调激活SOD活性,从而发挥肝脏保护作用。

弓形虫Chinese 1基因型虫株感染对小鼠海马体细胞超微结构的影响

目的观察弓形虫Chinese 1优势基因型TgCtwh3和TgCtwh6虫株对小鼠海马体细胞超微结构的影响。方法6周龄的雌性C57BL/6小鼠随机分为3组:对照组、TgCtwh3感染组、TgCtwh6感染组,每组6只。对照组腹腔注射无菌PBS;TgCtwh3感染组腹腔注射4000个TgCtwh3速殖子,饲养6 d;TgCtwh6感染组灌胃20个TgCtwh6包囊,饲养6周。所有动物经取材、制片,并用透射电子显微镜观察。结果与对照组相比,TgCtwh3感染组海马体细胞出现核皱缩坏死,胞质、轴突肿胀,细胞器消失,轴索断裂等病理变化。与对照组相比,TgCtwh6感染组海马体细胞出现线粒体肿胀、空泡化、嵴断裂消失、膜破裂,脂褐素沉积,高尔基体扩张等病理变化。结论TgCtwh3和TgCtwh6感染小鼠均出现海马体细胞超微结构的改变,TgCtwh3感染组多表现为不可逆的细胞坏死,而TgCtwh6感染组表现出线粒体结构破坏为主的慢性细胞损伤,这为探讨弓形虫脑病的致病机制奠定基础。

阜阳市HIV/AIDS患者弓形虫感染情况调查

目的了解安徽省阜阳市HIV/AIDS患者弓形虫的感染情况,以及弓形虫合并感染对患者CD_(4)^(+)T淋巴细胞计数的影响,为HIV/AIDS患者弓形虫病防控提供参考依据。方法以安徽省阜阳市2020年1月至2021年3月未经治疗新报告的HIV/AIDS患者为调查对象,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测其血清弓形虫IgG抗体,同时检测CD_(4)^(+)T淋巴细胞水平。结果共调查HIV/AIDS患者449例,其中,男性348例,女性75例,36例性别不详;年龄以20~60岁为主。检测出弓形虫IgG抗体阳性5例,阳性率为1.11%。弓形虫IgG抗体阴性的HIV/AIDS患者CD_(4)^(+)T淋巴细胞计数最低为1个/μL,最高为1616个/μL,中位数(四分位间距)为287(170,439)个/μL;弓形虫IgG抗体阳性的HIV/AIDS患者CD_(4)^(+)T淋巴细胞计数最低为43个/μL,最高为325个/μL,中位数(四分位间距)为139(86,237)个/μL,两者间差异无统计学意义(Z=-1.749,P>0.05)。结论安徽省阜阳市HIV/AIDS患者弓形虫感染率较低,CD_(4)^(+)T淋巴细胞水平与弓形虫感染之间的关系有待进一步研究。

弓形虫缓殖子期抗原1的原核表达及其多克隆抗体制备与初步应用

目的对弓形虫缓殖子期抗原1(BAG1)基因进行优化、克隆、原核表达,表达产物纯化后免疫小鼠,制备BAG1多克隆抗体,评价重组蛋白的免疫原性,并观察BAG1在虫体内的定位。方法对bag1基因序列进行筛选和优化,利用生物信息学方法分析其编码蛋白的氨基酸序列结构和功能,预测其免疫原性。将合成的pET28a(+)-bag1质粒转化至BL21感受态细胞中,加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度l mmol/L,37℃诱导4 h,用HIS标签蛋白纯化试剂盒纯化表达蛋白。取纯化蛋白做SDS-PAGE凝胶电泳分析,用BCA法测定蛋白浓度。取7只BALB/c小鼠,取纯化的BAG1蛋白与等体积的弗氏佐剂按双推法混匀,皮下多点注射免疫小鼠,每鼠每次注射蛋白25μg(第一次使用弗氏完全佐剂,后两次均使用弗氏不完全佐剂,每隔两周免疫一次),末次免疫4 d后摘眼球取血,分离血清,以此为一抗,采用Western blot检测碱性条件下我国流行优势基因型Chinese 1虫株(TgCtwh6)速殖子向缓殖子转化及含有TgCtwh6包囊小鼠脑组织中的BAG1蛋白,间接免疫荧光(IFA)试验检测TgCtwh6虫株碱性诱导成为缓殖子情况。结果预测BAG1含有7个潜在抗原表位,具有良好的免疫原性。Western blot显示,BAG1多克隆抗体能识别在体外碱性培养基诱导的TgCtwh6和小鼠脑组织内形成的TgCtwh6虫株缓殖子;IFA结果显示,BAG1多克隆抗体能识别体外诱导的TgCtwh6缓殖子,且BAG1蛋白主要定位在弓形虫的胞质中。结论成功制备弓形虫BAG1多克隆抗体,该抗体能识别我国优势流行虫株的BAG1蛋白及缓殖子,为我国流行虫株的监测和鉴定提供了良好的手段。

新冠肺炎患者肠道菌群变化的研究进展

呼吸道和肠道菌群的组成和功能失调与机体的免疫应答和肺部疾病密切有关。新冠肺炎病毒(SARS-CoV-2)的感染是其突刺蛋白与宿主细胞ACE2和TMPRSS4/TMPRSS2结合介导,以肺部表现为主的全身感染性疾病。在ACE2高度表达的小肠,病毒进入肠上皮细胞内导致ACE2表达减少,并通过mTOR通路降低小肠抗菌肽mRNA的表达从而影响肠道菌群,结果导致有抗炎作用的益生菌丰度下降。肠道菌群失调通过肠-肺轴(gut-lung axis)与气道微生物相互作用,通过降低短链脂肪酸(SCFA)水平等间接加重呼吸道损伤,导致肺部炎症和急性呼吸窘迫综合征(ARDS);肠道益生菌水解膳食纤维生成的SCFAs可促进Treg细胞的分化,抑制细胞因子风暴。另有报道,50%以上的新冠肺炎患者出现胃肠道症状,其中乳酸杆菌和双歧杆菌这两种典型益生菌丰度的下降尤其显著,提示以肺损害为主的新冠肺炎也可导致肠道微生态失调。肠道菌群在新冠肺炎发病和转归过程中可能发挥着重要作用。越来越多的证据表明,提高肠道菌群的丰度有助于治疗肺部疾病。本文对SARS-CoV-2与肠道菌群相互作用及在维持患者内稳态中的作用机制和病人的可能收益进行了综述。

Chinese 1型弓形虫眼病小鼠NK细胞亚群的初步分析

目的建立我国Chinese 1优势基因型获得性弓形虫眼病小鼠模型,分析弓形虫感染对眼组织局部NK细胞及CD49a^(+)NK细胞亚群的影响。方法C57BL/6小鼠经口感染20个弓形虫Wh6包囊,30d后取眼组织,苏木精和伊红(H&E)染色检查病理变化;采用PCR扩增眼组织中的弓形虫ITS-1基因;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和免疫组化方法分析眼组织中的干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等细胞因子的mRNA及蛋白表达水平;对眼组织转录组测序,进行基因表达差异分析、GO(gene ontology)富集分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析;采用流式细胞术检测眼组织中NK细胞和CD49a^(+)NK细胞亚群水平。结果H&E染色检查感染组小鼠视网膜发生严重的病理改变,PCR扩增眼组织中弓形虫特异性基因ITS-1阳性,qRT-PCR扩增眼组织中细胞因子IFN-γ、TNF-α的mRNA表达上调(P<0.01),免疫组化检查视网膜中IFN-γ、TNF-α表达上调。转录组测序显示,感染组小鼠眼组织中有601个基因表达上调,108个基因表达下调,GO富集分析中差异表达基因在免疫反应、炎症反应等生物过程显著富集,KEGG富集分析显示31个差异表达基因富集在NK细胞介导的细胞毒性通路。流式细胞术检测感染鼠眼组织中NK和CD49a^(+)NK细胞百分比显著增加(P<0.01)。结论成功构建了Chinese 1优势基因型获得性弓形虫眼病小鼠模型,感染鼠眼组织中NK细胞及CD49a^(+)NK细胞亚群百分比增加,提示NK细胞及CD49a^(+)NK细胞亚群在眼组织中积累可能参与弓形虫眼病的发生过程。

我国弓形虫Chinese 1优势基因型感染对小鼠脑组织铁代谢影响

目的 探讨我国弓形虫Chinese 1优势基因型感染对宿主脑组织铁代谢及脑损伤的影响。方法 将20只C57BL/6(体质量15~17 g)小鼠随机分为对照组和感染组,每组10只。感染组每只小鼠腹腔注射4 000个弓形虫Chinese 1优势基因型TgCtwh3虫株速殖子,对照组小鼠注射等量无菌PBS,饲养6 d后处死小鼠并取其脑组织。采用电感耦合等离子体质谱法(inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS)检测小鼠脑组织铁元素水平;采用RNA芯片检测两组小鼠脑组织差异基因数目并对功能基因表达情况进行基因本体论(Gene Ontology, GO)功能富集;采用实时荧光定量PCR(fluorescent quantitative real-time PCR, qPCR)技术检测小鼠脑组织中弓形虫表面抗原1(Toxoplasma gondii surface antigen1,TgSAG1)基因及部分锌铁调控蛋白(Zrt-and Irt-like protein, ZIP)家族mRNA表达水平;采用光镜和电镜观察小鼠脑组织海马齿轮回(dentate gyrus, DG)超微结构;采用Western blotting检测谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPx4)蛋白表达水平;采用硫代巴比妥酸(TBA)法检测丙二醛(malondialdehyde, MDA)水平;采用免疫组化检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)蛋白表达光密度(optical density, OD)值。结果 光镜下可见感染组小鼠脑组织海马DG区细胞坏死,电镜下见感染组小鼠脑组织海马区出现胞质空泡化、核皱缩坏死、线粒体嵴断裂消融、自噬小体增加等超微结构变化。与对照组相比,感染组小鼠脑组织中铁元素水平上调([32.92±0.90)μg/g vs(.37.72±1.10)μg/g;t=3.397, P <0.01];RNA芯片检测感染组小鼠脑组织发现721个基因上调、276个基因下调,差异表达基因在金属离子结合能力上有明显富集。与对照组相比,感染组小鼠脑组织金属元素转运体ZIP2 mRNA表达水平上调(t=8.659,P <0.05)、GPx4表达下降([1.046±0.025)vs.(0.720±0.101);t=3.129,P <0.01])、MDA水平升高([4.37±0.33)nmol/mgprot vs(.5.93±0.54)nmol/mgprot;t=2.451,P <0.05)]、VEGF蛋白平均OD值上调([0.348 3±0.017 8)vs.(0.490 6±0.010 5);t=6.641,P <0.01]。结论 Chinese 1优势基因型弓形虫感染后,小鼠脑组织中铁元素蓄积、抗氧化能力下调、氧化应激水平升高,提示弓形虫感染可影响宿主脑组织铁代谢而导致脑损伤。