增强型绿色荧光蛋白基因在日本血吸虫成虫体内的瞬时表达

目的探讨异源性增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因在日本血吸虫成虫体内表达的可能性。方法运用电穿孔技术将质粒pEGFP-C1导入日本血吸虫成虫体内,提取分离体外培养48小时成虫的基因组DNA、总RNA和全虫蛋白,分别用PCR、RT-PCR和Western blot验证转基因在成虫体内的存在、转录和翻译。同时,使用激光共聚焦扫描显微镜对EGFP在成虫体内进行定位。结果PCR和RT-PCR分别成功的扩增出760bp和276bp的预期大小的片断,Western-blot证实了EGFP基因在成虫体内的表达;激光共聚焦显微镜观察到,EGFP主要定位在成虫的皮层,口吸盘和尾部尤为明显。结论电穿孔技术成功地将异源基因引入日本血吸虫成虫体内并获得表达,为转基因血吸虫和基因功能的研究打下基础。

用电穿孔法将绿色荧光蛋白基因导入日本血吸虫童虫并表达

目的探讨增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因在日本血吸虫童虫体内异源表达,以及电穿孔技术在血吸虫基因转化中应用的可能性。方法应用电穿孔技术将质粒pEGFP-C1导入机械转化的日本血吸虫童虫体内,提取分离体外培养48 h童虫的基因组DNA、总RNA和全虫蛋白,分别用PCR、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blotting)验证转基因在童虫体内的存在、转录和翻译。同时,使用激光共聚焦扫描显微镜对EGFP在童虫体内进行定位。结果PCR和RT-PCR分别成功扩增出760 bp和276 bp的预期大小的片段,Western blotting证实了EGFP基因在童虫体内的表达;激光共聚焦显微镜观察表明EGFP主要定位在童虫的皮层和副皮层,虫体前端尤为明显。结论电穿孔技术成功地将异源基因引入日本血吸虫童虫体内并获得表达。

一个具有诊断价值的弓形虫基因的发现

目的用弓形虫成囊株感染的小鼠血清筛选弓形虫RH株速殖子cDNA文库,以寻找诊断弓形虫病的抗原基因。方法收集成囊株(Prugniaud株)慢性感染的小鼠血清,经滤膜吸附法去除大肠杆菌抗体,筛选弓形虫RH株速殖子cDNA文库。对3次复筛得到的阳性克隆进行插入片段的核苷酸序列测定,结果送GenBank进行同源性分析。根据序列测定结果,选取其中1个具有完整开放阅读框架的基因进行分析。结果获得4个持续阳性反应克隆。测序和同源性分析显示,WT1为弓形虫P30基因;WT4为弓形虫N-乙酰磷酸丙糖转移酶基因;WT9与已知的基因无同源性。WT12克隆基因与一未知的弓形虫基因有很高的同源性,且具有1个513bp大小的完整开放阅读框架,其蛋白质结构和功能预测可能是个跨膜信号蛋白。结论筛选得到的1个阳性克隆有望成为早期诊断抗原基因,值得进一步研究。

弓形虫表面抗原SAG1基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 体外扩增弓形虫 RH株膜表面抗原 SAG1编码基因 ,构建原核表达质粒 ,并表达 SAG1编码基因序列。方法 收集、纯化 RH株速殖子 ,提取 RNA,据已知的 SAG1基因序列 ,在设计合成的 1对引物中引入 Eco RI和 Hind 酶切位点。应用 RT-PCR技术 ,扩增 SAG1基因片段 ,插入原核表达质粒 p ET2 8a中 ,转化大肠杆菌 BL2 1 感受态细胞 ,重组子经 Eco RI和 Hind 双酶切、PCR鉴定 ,转化宿主菌 BL2 1 ,并以 IPTG诱导表达。结果 从弓形虫 RH株 RNA中扩增出 10 1 1 bp的 SAG1基因片段 ,构建重组质粒 p ET2 8a/ SAG1 ,酶切和 PCR鉴定产物大小均与预期值相符 ;IPTG诱导 ,SDS-PAGE显示表达产物的大小约 3 4.8k D。结论 成功地从弓形虫 RH株 RNA中获取 SAG1基因 ,构建了 p ET2 8a/ SAG1重组质粒并获得了高效表达 。

日本血吸虫酪氨酸羟化酶基因的克隆和序列分析

目的 克隆并鉴定日本血吸虫酪氨酸羟化酶(TH)基因,探讨其他信号蛋白在信号传导中对TH的调节及其之间的分子作用机制,从而为血吸虫新型疫苗的设计和药物开发开辟新的途径。 方法 以曼氏血吸虫的 TH cDNA为模板设计引物,以日本血吸虫成虫mRNA为模板逆转录合成cDNA链,将扩增出的日本血吸虫TH蛋白编码基因序列,克隆入 pGEM T easy载体,用单酶双切法和DNA测序进行鉴定,并与曼氏血吸虫的TH基因序列进行同源性比较。 结果 自日本血吸虫RNA经逆转录得到一长度为 480 bp的 DNA片段,经测序与曼氏血吸虫 TH的同源性为 87%。结论 成功扩增出日本血吸虫TH的中间编码区域,为进一步扩增日本血吸虫TH基因全长以及后续实验奠定了基础。

日本血吸虫信号蛋白14-3-3的虫体免疫定位

目的 研究抗重组日本血吸虫信号蛋白 1 4 3 3(rSj1 4 3 3)单克隆抗体对天然Sjl4 3 3的结合活性 ,观察Sj1 4 3 3在虫体内的定位。 方法 从阳性钉螺体内逸出尾蚴 ,感染家兔 ,分别于感染后 1 5d和 4 2d剖杀 ,静脉灌注法收集童虫和成虫制备冰冻切片。利用rSj1 4 3 3单克隆抗体 ,间接免疫荧光法探讨信号蛋白 1 4 3 3虫体内的分布。 结果 免疫荧光染色结果显示 ,rSj1 4 3 3单克隆抗体可特异性地结合天然Sj1 4 3 3抗原表位 ,背景清晰 ,Sj1 4 3 3广泛分布在雌、雄成虫的皮层、皮下层、肌层和实质层 ,前三种组织中特异性荧光呈线状分布 ,实质中特异性荧光弥散 ;童虫中Sj1 4 3 3也广泛的分布在皮层、皮下层、肌层和实质层。 结论 免疫荧光染色成功地确定了Sj1 4 3 3蛋白在成虫和 1

日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3(rSj14-3-3)及其单克隆抗体用于诊断的价值

目的探讨纯化的日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3(rSj14-3-3)及其相应单克隆抗体对日本血吸虫病的诊断价值。方法利用纯化的rSj14-3-3抗原和可溶性虫卵抗原(SEA)间接ELISA方法检测急、慢性日本血吸虫病患者血清中特异性抗体;以纯化的抗rSj14-3-3单克隆抗体包板,以兔抗rSj14-3-3多抗和酶标羊抗兔多抗为检测系统的酶标夹心法检测患者血清中的循环抗原。结果用rSj14-3-3检测急、慢性血吸虫病患者血清中特异性抗体的阳性率分别为100%和933%,用抗rSj14-3-3单克隆抗体检测循环抗原的阳性率分别为100%和956%,两者联合检测的总阳性率分别为100%和978%;经治疗后2、4、6、12个月,抗体转阴率分别为387%、548%、75%、90%,血清循环抗原转阴率分别为177%、419%、55%、85%,两者联合检测的总转阴率分别为452%、63%、85%、90%;对正常人血清的检测未见假阳性反应,与华支睾吸虫病和钩虫病患者血清出现轻微的交叉反应;用SEA检测抗体的阳性率分别为978%和956%,与正常人及华支睾吸虫病和钩虫病患者血清均有不同程度的交叉反应,治疗后2、4、6、12个月阴转率分别为32%、65%、125%、15%。结论rSj14-3-3检测急慢性血吸虫病患者血清中的特异性抗体和利用抗rSj14-3-3单克隆抗体检测循环抗原具有高度的特异性和敏感性。

重组人14-3-3zeta亚型单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

目的制备重组人14-3-3zeta亚型单克隆抗体(McAb),并检测14-3-3蛋白在人体组织器官的分布。方法将筛选出分泌抗人14-3-3zeta的杂交瘤细胞注射入BALB/c小鼠腹腔,制备腹水McAb,用辛酸-饱和硫酸铵沉淀法纯化,并鉴定其效价、纯度、浓度、特异性以及与天然抗原的亲和力,再用此单抗检测14-3-3蛋白在人体组织器官的分布。结果腹水及纯化后的单克隆抗体的效价分别为1∶107和1∶106。纯化后的纯度达97%,浓度为5mg/ml,能识别天然的人14-3-3蛋白,并能有效地识别兔和鼠脑组织的14-3-3蛋白。在人脑、肾、肺、肝、胃、卵巢、乳腺、结肠、胰腺等组织器官中,均检出14-3-3蛋白。结论已成功制备出重组人14-3-3zeta亚型单克隆抗体,并应用于实际检测,为研究14-3-3蛋白在机体生理和病理情况下的作用机制奠定了基础。

重组日本血吸虫14-3-3蛋白的纯化和鉴定

目的观察两次切胶、两次电洗脱的方法纯化重组日本血吸虫14-3-3(Sj14-3-3)蛋白的效果。方法采用两次切胶、两次电洗脱的方法(与经典的切胶、电洗脱有所不同),纯化Sj14-3-3蛋白,并与柱层析纯化方法进行比较。结果采用两次切胶、两次电洗脱方法纯化的目的蛋白条带单一,浓度达3mg/ml,而柱层析法纯化的蛋白浓度仅为1mg/ml。Western blot证实纯化目的蛋白的特异性。结论两次切胶、两次电洗脱法可获得高纯度、高特异性的目的蛋白,不失为一种经济有效的蛋白纯化方法。

重组弓形虫14-3-3抗原用于弓形虫血清抗体的检测

目的 探讨重组弓形虫信号转导蛋白14- 3- 3(Toxo14- 3- 3)在弓形虫病免疫诊断中的价值。方法 根据弓形虫Beverly株猫肠上皮细胞增殖阶段的14- 3 -3编码基因,设计合成引物,自RH株速殖子基因组克隆Toxo14- 3 -3的ORF,克隆pET 28a质粒,转化大肠杆菌,获得表达产物并纯化融合蛋白,以此抗原包被反应板进行ELISA检测,并与粗制抗原及市售试剂进行比较。结果 对400份血清标本的平行检测,Toxo14 -3 -3抗原、粗制抗原和市售试剂盒的阳性率分别为2 5%、3 0%和3 .25%,三者之间差异无显著性(P>0 .05);三者之间的符合率为99 0%、98.8%和99 .0%,差异无显著性(P>0. 05 )。结论 重组Toxo14 -3- 3抗原检测弓形虫血清抗体具有潜在价值。

日本血吸虫(中国大陆株)14-3-3信号蛋白的真核表达

目的 从日本血吸虫成虫 c DNA中扩增出信号蛋白 Sj1 4-3 -3编码基因 ,并亚克隆至真核表达载体 pc DNA3 .1( +) ,旨在制备重组诊断抗原和分子疫苗。方法 提取日本血吸虫成虫总 RNA,分离m RNA,RT-PCR法制备c DNA,并扩增出 Sj1 4-3 -3编码基因 ,通过线性 TA克隆载体 p GEM-T连接 ,亚克隆至真核表达载体 pc DNA3 .1 ( +) ,经转染至 COS-7细胞中表达 ,Western blotting鉴定。结果 RT-PCR产物、p GEM-T-Sj1 4-3 -3及 pc DNA3 .1 ( +) -Sj1 4-3 -3分别经双酶切后均获得一特异性基因片段 ,经 SDS-PAGE及 Western blotting鉴定后的分子量为 2 9k D。结论 真核表达重组质粒 pc DNA3 .1( +) -Sj1 4-3 -3在 COS-7细胞中的表达产物是一分子量为 2 9k D的蛋白 ,并能被抗 Sj1 4-3

红细胞碎片对白细胞计数结果的影响

目的分析在CD-1700型血液分析仪上作白细胞(WBC)计数检测时,在35 fl线附近出现一匕首样峰的异常白细胞直方图和不准确的白细胞计数结果的原因.方法对20例(肝病患者18例,新生儿2例)异常白细胞直方图的可能原因进行逐一分析;采用制片染色作显微镜检查,用稀释液洗涤红细胞后再用仪器检测和进行红细胞渗透脆性试验,同时对这些标本用显微镜目测法计数WBC,并与计数法结果进行配对t检验.结果出现异常直方图的WBC计数结果与目测法结果的差异有显著性(P＜0.01),仪器法结果显著增高,且这些标本的红细胞渗透脆性均显著降低. 结论白细胞计数假性增高与红细胞膜脆性变化密切相关.建议出现异常白细胞直方图时,须用显微镜目测法计数白细胞.

重组日本血吸虫信号蛋白14-3-3不同剂量对免疫保护性的影响

目的观察不同剂量重组日本血吸虫(中国大陆株)信号蛋白14-3-3(rSj14-3-3)的免疫保护性,以探讨最佳的免疫剂量。方法以逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)扩增Sj14-3-3基因,并将其亚克隆入原核表达载体pET28a,然后转化大肠埃希菌进行诱导表达;用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、电洗脱和透析的方法制备纯化的rSj14-3-3蛋白,分5组(第1、2、3组为rSj14-3-3蛋白50μg、100μg和300μg实验组,第4、5组分别为福氏佐剂和生理盐水对照组)免疫BALB／c小鼠并进行攻击感染实验。在尾蚴攻击感染6周后,剖杀小鼠计算各组的减虫率和减卵率。并在试验过程中留取不同时期小鼠血清,检测抗Sj14-3-3特异性IgG抗体。结果成功表达出rSj14- 3-3蛋白,纯化蛋白免疫小鼠行攻击感染后各实验组的减虫率为第1组28．20％、第2组43．10％、第3组40．00％;各组的减卵率分别为(按以上组序)41．80％、57．50％、55．70％。各实验组与对照组比较,差异有统计学意义(减虫率:第1组t=6．8、第2组t=8．7、第3组t=7．3,各组P值均<0．01;减卵率:第1组t=11．23、第2组t=11．54、第3组t=7．99,各组P值均<0．01);各实验组间两两比较,第1组与第2组间(减虫率:X2=8．96,P<0．05;减卵率:X2=15．69,P<0．05)、第1组与第3组间(减虫率:X2=6．52,P<0．05;减卵率:X2=12．52,P<0．05)差异有统计学意义;第2、3两组间差异无统计学意义(减虫率:X2=1．20,P>0．05;减卵率:X2=0．93,P>0．05)。各实验组的抗Sj14-3-3特异性总IgG水平都有显著升高,所测的4个亚型中以IgG1和IgG2a亚型升高为主,IgG2b和IgG3亚型升高不明显。结论重组Sj14-3-3的免疫保护性与免疫剂量有一定关系,以100μg抗原量免疫小鼠获得的保护性最好。