医学神经生物学教学素材收集体会

神经科学自20世纪以来受到各国科学界的普遍重视,医学神经生物学是随着神经科学的发展而兴起的新兴学科,是一门高度综合的医学基础科学。国内很多医学高校为了顺应这一发展,也相继开始了医学神经生物学课程。本文根据笔者近几年的教学经验,介绍医学神经生物学教学素材的收集体会。

神经干细胞原代培养及GABA能神经元的诱导分化

目的 探讨神经干细胞（NSC）的原代培养及γ-氨基丁酸（GABA）能神经元的诱导分化、鉴定。方法 取出生1—3dSD大鼠全脑，分离、培养NSC并诱导分化了GABA能神经元，用免疫荧光染色进行鉴定。结果培养24h后，由单细胞发展成2～4细胞神经球，随时间延长球体增大，神经球均有Nestin阳性细胞；用含10％血清分化液分化1d后，神经球开始贴壁，伸出细长突起，部分可和周边神经球伸出的突起连接。神经球周边见大量散在贴壁的双极或多极细胞，免疫荧光染色可见NSE、GABA阳性细胞。加了分化液的实验组GABA阳性细胞分化率为（30．25±2．12）％，而对照组分化率为（1．14±．39）％。结论 成功从新生大鼠脑组织中分离、培养了NSC，并能较大比率分化GABA能神经元。

1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶对食蟹猴嗅球多巴胺能神经元的影响

目的建立食蟹猴1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)帕金森病系统性模型,探讨嗅球中多巴胺(DA)及多巴胺/cAMP调节磷蛋白(DARPP32)的表达情况。方法 3只成年健康食蟹猴,静脉注射MPTP,建立帕金森病系统性模型,取出嗅球,切片,免疫组织化学染色DA和DARPP32,摄片并观察DA和DARPP32在食蟹猴嗅球中的分布及表达情况,采用Image Pro-Plus软件,半定量分析模型组和正常组之间DA和DARPP32的表达差异。结果食蟹猴嗅球中DA和DARPP32神经元集中分布于突触小球层,DA神经纤维分布于突触小球层,而DARPP32神经纤维分布于嗅球各层,以突触小球层(GL)和外网状层(EPL)最为密集。MPTP损伤后,与正常对照组比较,DA和DARPP32神经元及神经纤维均减少,以DA神经元及神经纤维减少明显。结论食蟹猴嗅球中DA神经元和神经纤维分布于突触小球层。食蟹猴MPTP帕金森病系统性模型的嗅球DA能神经元和纤维明显减少,可能与帕金森病嗅觉障碍有关。

葡萄籽原花青素对大鼠脑缺血再灌注后NF-κB、IκB和iNOS的影响

目的探讨葡萄籽原花青素(GSPE)对大鼠脑缺血再灌注后NF-κB,IκB和iNOS的影响。方法采用线栓法建立大鼠右侧大脑中动脉缺血再灌注模型。将72只SD大鼠随机均分成假手术组、缺血再灌注组和GSPE组,于缺血2 h再灌注6、24、48 h时断头取脑,选取视交叉前后各1 mm的脑组织,采用免疫组化法检测核因子-κB(NF-κB)、抑制蛋白-κB(IκB)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达,观察GSPE对其的影响。结果缺血再灌注组NF-κB的表达较GSPE组显著增加(P<0.01),而IκB表达却显著减少。结论局灶性脑缺血再灌注时,GSPE可通过抑制IκB的降解及NF-κB的活性、下调iNOS的表达,而起脑保护作用。

葡萄籽原花青素对脑缺血再灌注损伤的保护作用

目的:观察不同剂量葡萄籽原花青素对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的神经保护作用及其作用的不同途径。方法:实验于2004-10/2005-07在安徽医科大学神经生物实验室完成。取SD大鼠160只随机分成假手术组、模型组和葡萄籽原花青素50,100,200mg/kg组5组,每组32只。①缺血前30min模型组大鼠腹腔注射1mL生理盐水,葡萄籽原花青素50,100,200mg/kg组腹腔注射相应浓度的葡萄籽原花青素液1mL,6h后重复给药一次;假手术组不给药。②采用线栓法制备脑缺血再灌注大鼠模型,假手术组不栓塞动脉。各组随机取8只大鼠在再灌注12h断头处死测脑组织含水量;其余大鼠在再灌注24h断头处死取脑,分别检测脑梗死体积比、缺血侧脑组织超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量。结果:160只大鼠全部进入结果分析。①脑梗死体积比:葡萄籽原花青素100,200mg/kg组显著低于模型组(0.3077±0.0206,0.2972±0.0248,0.4594±0.0399,P<0.01)。②脑含水量:葡萄籽原花青素50,100,200mg/kg组均低于模型组[(79.97±0.76)%,(79.63±0.92)%,(79.67±0.51)%,(81.41±1.28)%,P<0.01]。③超氧化物歧化酶活性:葡萄籽原花青素50,100,200mg/kg组均高于模型组[(64.35±2.29),(64.52±2.20),(64.43±2.38),(39.72±6.94)NU/mg,P<0.01]。④丙二醛含量:葡萄籽原花青素50,100,200mg/kg组均低于模型组[(1.15±0.07),(1.11±0.16),(1.01±0.13),(1.42±0.23)μmol/g,P<0.01]。结论:①葡萄籽原花青素≥100mg/kg时可使局灶性脑缺血大鼠脑梗死体积减小,发挥有效的脑保护作用。②≥50mg/kg时即能增强抗氧化酶活性,减轻脂质过氧化损伤,减轻脑水肿程度。

大鼠颞叶癫痫发作后学习记忆功能障碍

目的探讨大鼠颞叶癫痫发作后学习记忆功能障碍的情况。方法建立大鼠颞叶癫痫模型,用Morris水迷宫实验评价颞叶癫痫发作后不同时间段学习记忆障碍的程度。结果大鼠颞叶癫痫发作后,定位航行实验和空间搜索实验均出现不同程度的障碍,障碍程度有随着颞叶癫痫发作时间的延长而加重的趋势。结论大鼠颞叶CA3区注射红藻氨酸后诱发颞叶癫痫长期发作会出现明显的学习记忆功能障碍。

帕金森病模型大鼠的学习记忆功能障碍

目的:利用Morris水迷宫对帕金森病模型大鼠的学习记忆障碍进行分析评价,为帕金森病的早期诊断及记忆障碍的治疗提供依据。方法:实验于2004-05/2005-04在安徽省立医院神经干细胞移植实验室及安徽医科大学神经生物学教研室完成。①筛选:制作帕金森病模型之前淘汰有记忆障碍的大鼠及有旋转行为的大鼠。②模型制备:采用立体定向技术建立6-羟多巴诱发的帕金森病大鼠模型。③检测指标:通过Morris水迷宫实验测定模型1个月时及3个月时大鼠寻找平台潜伏期、游泳距离、游泳速度、120s内在各象限游泳距离占总距离百分比。结果:共纳入实验大鼠74只,①淘汰了有记忆障碍、游泳时原地转圈及不成功模型共33只。最后纳入实验41只大鼠。帕金森病模型1个月组15只,帕金森病模型3个月组16只,对照组10只。②对照组大鼠与帕金森病模型1个月组大鼠游泳速度比较差异存在显著性(P<0.05)。帕金森病模型1个月组与3个月组比较差异不显著(P>0.05)。③帕金森病模型大鼠游泳距离明显增加,与对照组比较差异显著(P<0.05)。④对照组平台象限的距离与其他象限比较差异显著(P<0.05)。帕金森病模型1,3个月组各象限的游泳距离比较差异无显著性。结论:帕金森病模型大鼠表现出渐进的空间记忆能力和搜索策略的损害,与早期帕金森病患者表现的工作记忆损害相似。

泛素连接酶hHrd1在人乳腺癌组织表达的意义

目的探讨一种泛素连接酶hHrd1在人乳腺癌发病中的病理意义。方法应用免疫组织化学SP法研究正常人乳腺组织、乳腺增生症、乳腺纤维腺瘤、原发性乳腺癌组织中hHrdl的表达。结果人乳腺癌组织hHrd1蛋白表达水平明显强于正常人乳腺组织、乳腺增生症、乳腺纤维腺瘤。导管内癌(或伴早浸)与浸润性导管癌相比,表达水平低,差异有显著性意义(P<0.05)。人乳腺浸润性导管癌组织hHrd1表达与肿瘤大小有关(P<0.05),与组织学分级、淋巴结是否转移无关(P>0.05)。结论泛素连接酶hHrd1参与人乳腺癌的发生。

嗅球摘除昆明小鼠水迷宫和跨杆运动的改变

目的探讨嗅球摘除昆明小鼠的学习记忆行为及可能机制。方法制备嗅球摘除昆明小鼠模型,采用小鼠跨杆运动实验和小鼠水迷宫实验观察其学习记忆活动的改变;应用免疫组织化学方法观察前额叶皮质、边缘系统和纹状体CHAT的表达。结果嗅球完全摘除第14天昆明小鼠的游泳时间(P<0.01)和游泳错误次数(P<0.05)均较假手术组和嗅球不完全摘除组升高;嗅球完全摘除第14天小鼠的前额叶皮质、海马、内嗅区皮质、基底前脑M eynert基底核CHAT阳性神经元较假手术组数量减少,染色减弱,平均光密度值减少(P<0.01),而纹状体CHAT阳性神经元无明显改变。结论嗅球摘除昆明小鼠出现明显的陈述性学习记忆障碍,前额叶皮质、海马、内嗅区和M eynert基底核的胆碱能神经元减少,出现AD特征性的行为改变和生化改变。

吗啡成瘾大鼠脑内核团毁损后的行为学研究及形态学变化

目的研究脑内核团毁损对吗啡成瘾大鼠戒断症状及行为学方面的影响,以及毁损前后的脑形态学变化。方法将120只雄性SD大鼠随机分成对照组、吗啡成瘾组、伏核毁损组、海马毁损组及伏核、海马假毁损组,通过旷场实验和隔离残杀实验观察大鼠目的性探究行为和攻击行为的变化,并在光镜和电镜下观察脑内伏核、海马的形态学变化。结果成瘾组和毁损组在自然戒断症状、旷场实验、隔离残杀实验方面经统计学分析,组间差异有统计学意义(P<0.05);成瘾大鼠伏核、海马的神经元细胞器减少、线粒体肿胀、染色质边集、核固缩甚至坏死。结论长期使用吗啡可导致脑内神经元超微结构损害;毁损伏核、海马后可改善成瘾大鼠的戒断症状,使其探索行为和攻击性行为发生变化。

GFP-ATZ在HEK 293T中的表达及其细胞毒作用

目的构建具有绿色荧光蛋白(GFP)标签的α1抗胰蛋白酶Z突变型(ATZ)的真核表达载体,在人胚胎肾细胞(HEK293T)中验证表达情况及检测其对细胞的影响。方法以pcDNA3.1-zeo+-ATZ质粒为模版,设计引物,PCR扩增出ATZ的cDNA序列,插入真核表达载体pEGFP-C1中,构建带有GFP标签的ATZ真核表达载体pEGFP-C1-ATZ,脂质体转染体外培养的HEK293T细胞,Western blot、荧光显微镜和激光共聚焦显微镜检测GFP-ATZ在细胞中的表达、分布情况及其对细胞形态和分裂的影响。结果 ATZ片段成功插入pEGFP-C1表达质粒,在表达GFP的HEK293T细胞内,绿色荧光呈弥散的全细胞分布,而表达GFP-ATZ的细胞绿色荧光分布于细胞质内;Western blot结果显示特异性条带,分子量大小与GFP-ATZ预期相符;GFP-ATZ的过度表达引起细胞出现不同程度的形态改变、分裂障碍、聚集体出现甚至死亡。结论成功构建了具有绿色荧光标记的ATZ真核表达载体,GFP-ATZ的表达具有细胞毒性。

皮层电刺激对左旋多巴诱发异动症大鼠纹状体c-fos及ENK表达的影响

为了研究皮层电刺激对左旋多巴诱发异动症(LID)大鼠纹状体神经元c-fos及脑啡肽(ENK)表达的影响,探讨皮层-纹状体通路可塑性改变在LID发生机制中的作用,本实验制备Parkinson病(PD)和LID大鼠模型,将实验大鼠分成三组:正常对照组、PD组和LID组。电刺激运动皮层后,免疫组化法检测纹状体区c-fos、ENK、细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)及其活化形式磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(p-ERK1/2)的表达。结果显示:与对侧比较,皮层电刺激使各组同侧纹状体c-fos、ENK、ERK1/2、p-ERK1/2表达均增加(P<0.01);LID组c-fos(0.67±0.03)以及p-ERK1/2的表达(0.17±0.05)较PD组(0.08±0.03)和正常组(0.07±0.02)增加(P<0.05),LID组ENK(0.21±0.07)的表达和PD组(0.18±0.08)相比较无统计学差异(P>0.05),但均较正常组(0.08±0.01)增加(P<0.01);三组ERK1/2的表达无统计学差异(P>0.05),但LID组p-ERK1/2的表达(0.17±0.05)较PD组和正常组有所增加(P<0.01)。本研究结果表明,LID大鼠皮层-纹状体通路兴奋使纹状体c-fos以及p-ERK1/2表达增加,ENK的表达没有显著变化。上述结果提示皮层-纹状体通路活动增强以及p-ERK1/2表达的增加与LID的发生机制有关,而ENK在LID的发生过程中可能不发挥重要作用。

帕金森病MPTP食蟹猴模型嗅球细胞凋亡

目的建立1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)帕金森病(PD)模型,探讨模型组嗅球细胞凋亡和胶质细胞增生情况。方法 3只成年健康食蟹猴,静脉注射MPTP建立PD模型,另3只静脉注射生理盐水作为对照。取出嗅球,免疫组织化学染色检测Caspase-3、Bcl-2、离子钙接头蛋白分子1(Iba-1)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)在食蟹猴嗅球中的表达情况,采用Image J v1.8.0软件分析模型组和对照组之间的差异。结果 MPTP损伤后,与对照组相比,模型组嗅球突触小球层Caspase-3阳性细胞数明显增加,而Bcl-2表达减少;与对照组相比,模型组嗅球突触小球层和外网状层的GFAP和Iba-1阳性细胞数增加。结论 MPTP可诱导食蟹猴嗅球突触小球层细胞凋亡,并伴有星形胶质细胞增生和小胶质细胞激活,这可能与帕金森病的功能障碍有关。

胶质瘤干细胞表面标志物的研究进展

胶质瘤干细胞(glioma stem cells,GSCs)的存在使得胶质瘤,尤其是恶性胶质瘤,临床治疗变得困难,手术、放疗及化疗等一系列传统治疗正在面临挑战。因此,寻求优于现有疗法的有效安全的分子靶向治疗是必要的。GSCs表面标志物相对于其它类型标志物更有优势是由于前者暴露在细胞表面而更容易与抗胶质瘤分子结合,从而获得特异疗效,因此表面标志物最适于作为治疗靶点,为GSCs的鉴定、治疗提供便利。1 CD133作为GSCs表面标志物的局限性CD133也称为Prominin-1,是一种细胞表面受体,被作为脑肿瘤干细胞的标志物。Wang等[1]研究认为致瘤性人胶质瘤细胞系并不表达CD133,其不是恶性脑肿瘤起源所必需的。早先的研究认为CD133-细胞没有增殖产生脑肿瘤的能力。

一种新型转移诱导蛋白AGR2在乳腺癌中的表达及其临床和预后意义

目的研究转移诱导蛋白AGR2在人乳腺癌中表达和意义及其与患者预后的关系。方法采用组织芯片，应用免疫组织化学方法检测160例乳腺癌和20例乳腺良性病变组织AGR2表达，以及乳腺癌ERd、PR和HER2表达状况，并用Kaplan—Meier曲线法和Log-rank检验对有随访资料的127例进行与AGR2的相关性分析。结果乳腺癌AGR2表达量较乳腺良性病变显著性增高（68．3％和25．0％，P〈0．01）；AGR2表达与乳腺癌组织学分级呈负相关（P〈0．05），与乳腺癌ERα和PR表达呈正相关（分别为P〈0．05和P〈0．01）；Logistic回归模型显示AGR2和TNM分期是ERα阳性乳腺癌淋巴结转移重要的影响因子（均P〈0．01）；Kaplan—Meier生存曲线显示ERα阳性乳腺癌患者中，AGR2阳性患者总生存率和无复发生存率均显著低于阴性患者（均P〈0．01），COX比例风险模型分析也证实AGR2蛋白表达是ERα阳性乳腺癌患者独立的预后影响因子（P〈0．01）。结论AGR2表达异常可能参与了乳腺癌的发生、发展过程，该机制可能部分依赖雌激素受体途径发挥其诱导肿瘤转移作用。AGR2可能是一个潜在的分子标记物，对雌激素受体阳性乳腺癌患者的预后评估有一定提示作用。

AGR2基因在子宫内膜癌组织中的表达及其意义

AGR2基因是一种与人类早期阶段前后位分化相关的基因，位于染色体7p21．3，编码一种分泌性蛋白质，是非洲爪蛙黏液腺基因XAG2（xenopus laevis anterior gradient-2）的人型同源物。在最近的研究中发现，AGR2基因在人前列腺癌和乳腺癌中表达率增高，是与肿瘤分化、转移相关的基因。子宫内膜癌是女性常见的恶性肿瘤之一，