新冠疫情下开放科研实验室管理的专家共识

2019新型冠状病毒的暴发给实验管理带来了新的挑战,鉴于目前形势下疫情的风险,建议各实验室务必提高工作中的风险意识,增强防护,加强管理,特提出以下建议:一、加强科研实验室开放管理1.加强入室人员的培训,除传统的实验室生物安全培训外,增加新型冠状病毒的传播和防控知识培训,并进行考核,未通过者不得进入实验室开展实验。

医学类高校科研实验室在新冠肺炎疫情防控期间安全管理工作探讨

通过总结医学类高校科研实验室管理的特点和难点,从人员管理、制度落实和安全保障等方面提出加强实验室安全保障的建议,为疫情防控期间医学类高校科研实验室安全管理提供借鉴。

医学院校公共科研平台质谱管理工作探讨

在医学类高校公共科研平台,利用质谱仪开展科学研究的需求日益增多。同时以质谱仪为主的代谢组学和蛋白质组学平台建设,在近几年发展迅速。但在质谱平台的建设、管理和运行方面却存在很多的管理短板和难点。文章对质谱仪的基本理论、实验的一般流程、日常故障类型和解决思路、质谱平台的建设、维护和管理等方面进行了总结,给读者在质谱平台的建设和管理提供一定的参考和建议。

医学院校研究生实验室安全意识情况调查与分析

目的:调查了解医学院校研究生实验室安全意识及高校实验室安全教育与管理现状,为改进实验室安全管理提供建议。方法:采用随机数表法抽取109名研究生,使用自行设计的"医学院校研究生实验室安全意识调查表",从实验室安全规章制度、实验室安全设施、实验操作规范、仪器设备操作规范、废弃物处理和实验室安全培训6方面进行问卷调查,针对调查结果进行分析并制定改进措施。结果:被调查的研究生中89.91%熟知国家、学校及各实验室相应的实验室安全管理规定;31.19%的研究生"不知道"或"不清楚"所在实验室(楼)的紧急安全通道位置,仅有41.28%的研究生会正确使用消防器材;77.98%的研究生表示实验时会穿戴防护性器具;仅有32.11%的研究生接受过系统的实验室安全培训。结论:医学院校研究生实验室的安全意识有待加强,实验室安全教育及基础设施配置需进一步改善,高校应继续加强实验室安全教育,及时补充完善安全设施,为科研工作者提供安全、规范的实验环境。

医学院校科研共享平台建设与管理模式探索

医学院校科研共享平台是服务高校乃至社会科技发展的重要部分。本文以安徽医科大学科研实验中心的建设发展为例,阐述了科研共享平台的建设规划、仪器配置、管理机制及运行成效等,初步探索了建设与管理模式,为医学院校科研共享平台的管理发展提供参考。

细胞培养实验平台的管理经验探讨

细胞培养室是生命科学研究领域科研成果产出的核心场所,规范化管理是细胞培养室科学和高效运行的必要条件。从安徽医科大学科研实验中心细胞培养实验平台管理的实际经验出发,探讨细胞培养室的制度建设、环境管理和安全管理等问题,并对制度建设和环境管理进行重点阐述。

IL-10调控HaCaT细胞增殖及分化的分子机制

目的探讨白细胞介素10(IL-10)对皮肤角质形成细胞(HaCaT)增殖影响和对氯化钙(CaCl 2)诱导的角质形成细胞分化标志物的表达影响及其可能的分子机制。方法以不同浓度IL-10(0、3、10、30 ng/ml)处理HaCaT细胞不同时间(0、24、48、72 h),MTS分析细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期;IL-10(终浓度为10 ng/ml)预处理HaCaT 1 h,加入或不加CaCl 2(终浓度为1.2 mmol/L)培养24、48、72 h,Western blot检测IL-10对HaCaT分化标志物表达影响;丝裂原蛋白激活激酶-胞外信号调节激酶(MAPKs-ERK1/2)特异性抑制剂PD98059及磷脂酰肌醇激酶-丝氨酸/苏氨酸激酶(PI3K-AKT)特异性抑制剂LY294002预处理HaCaT细胞,分别提取细胞总RNA和蛋白,荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western blot检测IL-10对HaCaT细胞分化标志物(Keratin1、Keratin5、Involucrin)表达影响。结果MTS结果显示,在72 h内,IL-10(30 ng/ml和较低浓度)对HaCaT细胞增殖无影响;流式细胞分析结果提示IL-10不影响HaCaT细胞周期进程。Western blot分析显示,IL-10上调HaCaT角质形成细胞角质细胞分化标志物Involucrin表达,而对Keratin1及Keratin5没有显著的影响。机制研究分析显示,IL-10能够活化ERK1/2和AKT,增加其磷酸化水平;RT-qPCR和Western blot结果显示PD98059及LY294002部分阻断IL-10诱导的Involucrin的表达。结论IL-10在一定浓度范围内不影响HaCaT的增殖;IL-10部分通过MAPKs-ERK1/2和PI3K-AKT途径上调HaCaT分化标志物Involucrin表达。

紫檀芪减轻小鼠肝窦内皮细胞氧化损伤的机制

目的探索天然的酚类化合物紫檀芪(pterostilbene,PTE)减轻小鼠肝窦内皮细胞氧化损伤的机制。方法40只C57小鼠分为对照组、模型组、治疗组建立70%肝脏缺血/再灌注(缺血60 min)模型,并通过灌注和消化法分离原代肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cells,LSECs)。通过HE染色观察肝脏结构;透射电镜(TEM)观察肝窦内皮细胞超微结构;扫描电镜(SEM)观察LSECs窗孔的结构;Western blot检测LSECs内血红素氧化酶-1(heme oxygenase 1,HO-1)表达水平。结果HE染色显示,PTE能够改善肝脏缺血性损伤;TEM观察到PTE对肝窦内皮细胞具有保护作用;扫描电镜观察发现,空白对照组LSECs窗孔数量较多,模型组窗孔数量减少;与模型组比较,治疗组LSECs窗孔数量有所增加。Western blot结果显示,PTE能够诱导LSECs中HO-1表达。结论PTE通过诱导血红素氧化酶-1表达减轻小鼠肝窦内皮细胞氧化损伤,保护肝脏免受缺血/再灌注损伤。

Sigirr缺失调控NF-κB并参与慢性肾病小鼠发生肾间质纤维化

目的研究Sigirr基因缺失小鼠在慢性肾病(CKD)并发肾间质纤维化(RIF)中的作用和机制。方法利用PCR鉴定正常基因型(Sigirr^(+/+))小鼠和Sigirr基因缺失(Sigirr^(-/-))小鼠。含0.2%高腺嘌呤饲料喂养小鼠,连续喂养12周,以建立慢性肾脏损伤并发RIF模型。收集小鼠眼框静脉血以检测肾功能;利用HE染色分析肾脏组织病理变化,通过Masson染色观察肾脏纤维化程度,利用IHC和Western blot检测白细胞介素(IL)-1β、MyD88和NF-κB等信号分子变化,同时观察转化生长因子(TGF)-β1、E-cadherin和Vimentin的表达变化。结果肾功能检测结果显示高腺嘌呤喂养小鼠的血清肌酐和尿素氮较对照组增加;HE和Masson染色结果显示:与Sigirr^(+/+)小鼠比较,Sigirr^(-/-)小鼠的肾组织中,炎症细胞浸润和胶原纤维沉积更明显。IHC和Western blot结果显示IL-1β及其下游的MyD88表达增加,p-P65水平显著增加;Sigirr^(-/-)小鼠的肾组织中IL-1β、MyD88、p-P65等变化较Sigirr^(+/+)小鼠显著;同时TGF-β1显著增加,且Vimentin的表达增加,E-cadherin的表达明显降低,Western blot检测Vimentin、E-cadherin结果与免疫组化一致,且α-SMA也显著升高。结论高腺嘌呤饮食可以建立CKD并发RIF小鼠模型。Sigirr的缺失增加肾间质IL-1β介导NF-κB信号通路的活化,促进TGF-β1表达,有利于上皮-间质细胞转分化相关RIF过程。

基于CRISPR/Cas9系统建立GPR108缺失的THP-1细胞株及其功能初步研究

目的建立稳定敲除G蛋白偶联受体108(GPR108)基因的人单核细胞白血病细胞系(THP-1),并初步研究其功能。方法根据人GPR108基因序列设计,合成可应用于成簇有规律的间隔短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)的单链引导RNA(sgRNA1和sgRNA2)对应的DNA,利用分子克隆技术在pL-CRISPR.EFS.GFP慢病毒载体中插入sgRNA1和sgRNA2序列,构建重组载体(pL-CRISPR.EFS.GFP-sgRNA1和pL-CRISPR.EFS.GFP-sgRNA2)。将测序正确的重组体与包装质粒(pMD2.G和psPAX2)共转染293T细胞进行病毒包装,收集病毒液并感染THP-1细胞。利用流式细胞分选技术分离GFP+细胞于96孔培养板中,培养获得单细胞克隆。利用聚合酶链式反应(PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测THP-1细胞中GPR108是否敲除成功。应用脂多糖(LPS)刺激GPR108-/-和GPR108+/+的THP-1细胞,Western blot法检测细胞内白细胞介素-8(IL-8)的表达,流式微球技术(CBA)检测细胞培养上清液中的IL-8浓度。结果成功构建重组慢病毒载体pL-CRISPR.EFS.GFP-sgRNA,转染THP-1细胞后通过流式细胞仪分选获得单细胞克隆F9。PCR和Western blot法均证实F9是GPR108-/-THP-1单细胞克隆。LPS刺激GPR108-/-和GPR108+/+THP-1细胞,Western blot和CBA的结果均显示敲除GPR108的THP-1细胞中IL-8的合成和分泌明显减少。结论成功建立GPR108缺失的THP-1细胞株;缺失GPR108的THP-1细胞在受到LPS刺激时产生的趋化因子IL-8显著降低。为后续研究GPR108在免疫炎症中的作用奠定了基础。

基于超高效液相色谱-静电场轨道阱质谱技术的十二味参芍益脑合剂中12种主要化学成分定量检测研究

目的基于超高效液相色谱-静电场轨道阱质谱技术,同时测定十二味参芍益脑合剂中12种主要化学成分(绿原酸、栀子苷、芍药苷、芍药内酯苷、甘草苷、黄芩苷、芹菜素、甘草素、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和千层纸素A)的含量。方法该研究起止时间为2021年3月至2022年5月。采用Waters UPLC HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.8µm),以乙腈-0.1%甲酸和10 mmol/L甲酸铵水溶液为流动相,线性梯度洗脱,流速0.25 mL/min,柱温35℃,采用电喷雾离子化,平行反应监测离子扫描,以负离子模式检测16批十二味参芍益脑合剂。结果测定的12种主要化学成分在检测浓度范围内线性关系良好(r>0.99),加样回收率范围为80.58%~112.90%[相对标准差(RSD)<10%],基质效应范围为76.58%~110.80%(RSD<10%),进样精密度、重复性、稳定性均符合方法学测定要求。16批制剂检测结果显示13批质量相对稳定,其余3批有一定差异,栀子苷可以作为进一步评价制剂质量的指标。结论该方法专属性强、灵敏度高、重复性好,准确可靠,可用于十二味参芍益脑合剂中12种主要化学成分的同步含量测定。

生物样本中可替宁检测技术的研究进展

可替宁是目前评价环境烟草烟雾暴露的最佳生物标志物,检测生物样本中的可替宁,可以获得人体烟草暴露的相关信息。根据研究的生物样本类型和特点,选择适宜的前处理和检测方法尤为重要。本文从可替宁检测的应用、研究思路、常见检测样本类型和特点、生物样本中可替宁检测难点、样品前处理方法和检测方法6个方面进行总结,阐述了生物样本中可替宁检测技术的研究进展,为生物样本中可替宁的检测提供参考。

柏子养心丸挥发性化学成分的GC-MS分析

[目的]通过GC-MS技术,研究柏子养心丸中的挥发性成分。[方法]用正己烷、乙酸乙酯和无水乙醇3种不同溶剂,分别对柏子养心丸的挥发性成分进行超声提取,采用HP-5 MS(30 m×250μm×0.25μm)色谱柱进行分离,分析3种方法提取的挥发性成分,综合解析柏子养心丸的挥发性化学物质基础。[结果]从柏子养心丸中共鉴定出23种挥发性成分,正己烷、乙酸乙酯和无水乙醇超声提取法鉴定的成分数量分别为19、20、21种,共有化合物有18个;3种方法提取的挥发性成分数量、种类差异和物质分子量分布较小,物质的相对含量具有一定的差异;酯类物质是柏子养心丸中挥发性成分的最主要一类物质,藁本内酯可能是柏子养心丸中含量最高的挥发性物质。[结论]该研究初步探明了柏子养心丸中的挥发性成分的组成和相对含量,为柏子养心丸的复方配伍-物质基础-药理作用提供物质研究基础。

葛根芩连片配伍后葛根素在大鼠体内药动学研究

目的建立测定血浆中葛根素浓度的UPLC-MS/MS方法,探究葛根芩连片复方配伍对葛根素在大鼠体内的药动学行为的影响。方法采用甲醇沉淀蛋白法处理血浆样品,以Waters Acquity UPLC HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm)进行分离;电喷雾负离子化平行反应离子监测模式检测。结果血浆中葛根素质量浓度在2.500~300.0 ng·mL^(-1)与色谱响应线性关系良好,最低定量限为2.500 ng·mL^(-1),经方法学验证符合生物样本分析要求。大鼠灌胃葛根芩连片、葛根单味药和葛根素对照品后,Cmax分别为(208.2±51.29)、(81.04±11.71)、(88.40±10.79)μg·L^(-1),tmax分别为(0.5±0.0)、(0.6±0.4)、(0.2±0.0)h,t1/2分别为(2.1±0.1)、(1.7±0.1)、(2.0±0.3)h,AUC0~8分别为(186.3±18.98)、(140.0±21.45)、(124.2±44.04)μg·h·L^(-1),AUC0~∞分别为(199.0±16.85)、(144.3±22.42)、(133.1±44.90)μg·h·L^(-1)。结论成功建立了血浆中葛根素的UPLC-MS/MS测定方法,葛根芩连片复方配伍能够改善制剂中主成分葛根素在体内的代谢行为,具有协同增效的作用。

跨膜蛋白173对TGF-β1活化的肝星状细胞增殖与凋亡的影响及机制研究

目的观察跨膜蛋白173(TMEM173)的表达变化对TGF-β1诱导活化的人肝星状细胞(LX-2)增殖和凋亡的影响及其机制。方法TGF-β1诱导建立LX-2细胞活化模型,分别利用MTT、EdU和FCM技术检测TMEM173的表达变化对活化LX-2细胞增殖和凋亡的影响,并进一步利用WB技术检测其对细胞增殖和凋亡相关通路蛋白表达的影响。结果TGF-β1成功诱导LX-2细胞活化,且与对照组相比,GFP-TMEM173组细胞的增殖率明显升高、且凋亡率明显降低,而TMEM173-siRNA组细胞的结果则相反;另外,与对照组相比,GFP-TMEM173组细胞中PCNA和Bcl-2的蛋白表达水平明显上调,且Bax、cleaved-caspase-3和cleaved-PARP的表达水平明显下调,而TMEM173-siRNA组细胞的结果则相反。结论TMEM173对活化LX-2细胞的增殖和凋亡具有调控功能,即其过表达能够促进LX-2细胞增殖和抑制细胞凋亡,反之则抑制LX-2细胞增殖和促进细胞凋亡,表明TMEM173可能在肝星状细胞增殖与活化过程中扮演着积极的角色,是肝纤维化基因治疗的潜在靶点。

人G蛋白偶联受体107表达载体构建及细胞定位的研究

目的克隆人G蛋白偶联受体107(GPR107)基因以构建真核表达载体,并探讨GPR107在真核细胞中的亚细胞定位。方法通过分子克隆技术克隆人GPR107基因的cDNA;利用真核细胞表达载体pCMV-Tag2B构建重组载体pCMV-Tag2B-GPR107,瞬时转染至293T细胞,Western blot检测GPR107的表达变化;采用免疫荧光标记,激光共聚焦显微镜观察GPR107在细胞中的定位。结果经过基因测序证实获得人GPR107的cDNA;成功构建真核表达载体pCMV-Tag2B-GPR107;Western blot结果显示,与未转染组比较,转染组GPR107表达量明显上调。激光共聚焦显微镜观察显示GPR107主要表达于细胞质。结论GPR107在293T细胞中过表达,并定位于细胞质。

基于双五氟苄基硫醚的气相色谱-质谱法测定大鼠脑组织中的H_(2)S

目的通过气相色谱-质谱(GC-MS)法测定硫化氢(H_(2)S)的衍生化产物双五氟苄基硫醚(bispentafluorobenzyl sulfide,C_(6)F_(5)CH_(2)SCH_(2)C_(6)F_(5)),建立大鼠脑组织中H_(2)S的测定方法。方法色谱条件:HP-5MS(30 m×250μm×0.25μm)色谱柱,色谱柱程序升温,进样口温度280℃。质谱条件:20 eV电子轰击离子源,离子源温度230℃,四极杆温度150℃,接口温度280℃。采用多反应检测扫描(MRM)模式,对C_(6)F_(5)CH_(2)SCH_(2)C_(6)F_(5)的离子对(m/z 394→181,m/z 181→161)进行定量、定性分析。结果脑组织样本中硫氢化钠(NaHS)在0.25~256μmol·L^(-1)范围内具有良好的线性关系,检测限为0.1μmol·L^(-1)。日内、日间精密度均小于15%,无明显的基质效应,回收率在90%以上。可选择性测定脑组织中的H_(2)S,测得大鼠脑皮质组织中基础H_(2)S浓度为(11.84±0.38)μmol·L^(-1),静脉注射NaHS后,脑组织中H_(2)S浓度呈剂量依赖性增高。结论C_(6)F_(5)CH_(2)SCH_(2)C_(6)F_(5)的GC-MS法是测定大鼠脑组织中H_(2)S的一种可靠、有效的方法,H_(2)S可透过血脑屏障进入脑组织。

RB1-C磷酸化位点突变体与Sedlin的共定位研究

目的研究人视网膜母细胞瘤蛋白1羧基端(RB1-C)磷酸化位点突变体的蛋白表达和细胞定位情况及其与迟发性脊椎骨骺发育不良病蛋白(Sedlin)共定位的变化情况。方法设计RB1-C磷酸化位点突变体的引物,以质粒pcDNA3.1-FLAG-RB1-C为模板,利用PCR技术分别扩增出pcDNA3.1-FLAG-RB1-C-S788A、S795A、S807A、T811A、T821A、T826A共6个突变体,并对各位点进行测序。分别将以上突变体单独转染至HEK 293T、COS7细胞中,利用Western blot和免疫荧光(IF)技术观察其蛋白表达和细胞定位情况;分别将以上突变体及Sedlin共同转染至COS7细胞中,利用IF技术观察二者在细胞内的共定位情况,并与野生型RB1-C的结果进行比较分析。结果测序结果显示RB1-C的6个磷酸化位点均突变成功,并能够在真核细胞内正常表达,且与野生型RB1-C的细胞定位基本一致,即主要定位在细胞核内。与野生型RB1-C相比,RB1-C-S788A、S795A、T821A、T826A与Sedlin的共定位未发生改变,即主要共定位在细胞核内;但RB1-C-S807A、T811A与Sedlin的共定位发生了显著变化,除了共定位于细胞核外,在细胞质中也存在共定位现象。结论RB1-C磷酸化位点突变体成功构建并表达,其中S807A、T811A两个磷酸化位点的突变能够显著改变RB1-C与Sedlin在细胞中共定位区域,表明它们是RB1-C和Sedlin结合的关键位点之一,为进一步研究RB1-C和Sedlin的相互作用奠定了基础。

基于UHPLC-MS/MS法,中毒量氯化琥珀胆碱在大鼠体内分布的研究

目的建立适当的超高效液相色谱串联质谱(UHPLC-MS/MS)法,测定中毒量氯化琥珀胆碱(succinylcholine chloride,Suc)在大鼠体内的分布。方法大鼠分别皮下注射3种剂量的Suc,4 h后取大鼠血清和各主要脏器组织进行乙腈蛋白沉淀并过固相萃取WCX柱进行纯化;色谱采用Luna NH2色谱柱(2 mm×100 mm,3μm),流动相为0.1%甲酸水溶液-乙腈等度洗脱,质谱测定采用正离子扫描下多反应监测模式(MRM)。对Suc离子对(m/z 145.1→93.3,m/z 145.1→115.4)进行定性、定量分析。结果Suc的检测限是0.01μg·L^-1,回收率为89.5%~95.4%,日内、日间RSD均小于15%。除NS对照组外,3种剂量的Suc组大鼠的血清及心、肝、肾等主要脏器组织中均检测到Suc,并且肾组织中的Suc最高。结论大鼠Suc中毒时在血清及心、肝、肾等组织中均有分布,其中肾脏中含量最高;UHPLC-MS/MS法是检测Suc中毒大鼠体内药量的一个有效、可靠的方法。

基于转录组测序筛选不同性别C57BL/6J小鼠差异基因及通路

目的通过转录组测序筛选雌性与雄性C57BL/6J小鼠差异基因及通路,为进一步探讨小鼠雌雄间行为学差异的分子机制奠定基础。方法C57BL/6J品系的8周龄雌性与雄性小鼠,完整分离小鼠海马体组织,提取总RNA后逆转录构建cDNA文库,并在华大基因平台上生成单端为50个碱基的读数进行转录组测序。测序结束后基于GO和KEGG数据库,结合R语言中的phyper函数对数据进行筛选、校正和富集分析,计算P值;然后对P值进行矫正得到Q值并基于超几何测试方法对带注释的不同基因表达情况进行了分析,筛选出不同性别小鼠海马体中的差异基因及通路。测序结束后,使用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)验证在雌雄小鼠海马中筛选出的差异基因并比较差异基因在不同信号通路上的表达情况。结果通过雌雄差异比较,筛选出325个差异基因,其中上调基因233个,下调基因92个,这些差异基因功能主要富集于长时程增强(LTP)、钙离子信号通路、尼古丁成瘾等过程;雌雄差异基因相互作用网络共有362个连接点和1703个相互作用边,筛选出的10个核心基因分别为:赖氨酸脱甲基酶5D(Kdm5d)、细胞周期蛋白依赖性激酶5(Cdkl5)、细胞输出介质(Cle1)、多巴胺受体6a3(Slc6a3)、盒式转录因子(Fox)、前体mRNA加工因子4B(Prpf4b)、甘氨酸受体4(Glur4)、钙离子受体2(Camk2)、DNA和RNA结合蛋白家族(Son)、5-羟色胺受体5b(Htr5b)。RT-qPCR验证结果与测序结果一致。结论从雌雄小鼠海马体中筛选出差异基因为研究不同性别小鼠行为学差异提供实验思路并为后续小鼠行为学研究做出针对性实验设计。