一种检测细菌性阴道病方法的建立及临床评价

目的评估一种国内自主建立利用唾液酸酶检测细菌性阴道病（BV）方法的临床应用价值。方法比色法探索研发试剂与酶标准品的最佳反应条件,包括底物溶液的pH值和反应的最适温度及时间。采用研发试剂、BV BLUE、临床现用国产试剂盒对临床标本进行检测,判断研发试剂的临床应用价值。结果研发试剂在pH值6.0-6.2、37℃10 min时与酶标准品达到最佳反应,与BV BLUE相比,检出限相同时研发试剂底物用量仅为BV BLUE的1/2.78。临床实验中,研发试剂与BV BLUE对BV的检测效果差异无统计学意义（P=1.000,Kappa=0.905）,符合率为96%。而国产试剂盒与BV BLUE对BV的检测效果差异有统计学意义（P=0.000,Kappa=0.362）,符合率为65%。结论研发试剂可以达到与BV BLUE相同的检出效果,其快速、方便、可信度高且成本较低,优于国内类似产品,更有利于在临床推广和使用。

氨甲蝶呤对映体耐药A549细胞株的建立及其生物学特征

目的诱导并建立耐氨甲蝶呤对映体的A549细胞株并观察耐药细胞系(L-(+)-MTX/A549、D-(-)-MTX/A549)的生物学特性。方法以MTX对映体为诱导剂,采用浓度递增结合低剂量持续诱导方法诱导A549细胞株,建立MTX不同对映体耐药细胞系;倒置相差显微镜观察细胞形态变化;MTT法绘制细胞生长曲线;MTT法检测耐药细胞株的耐药指数;流式细胞仪检测细胞周期和细胞的分裂增殖能力。结果L-(+)-MTX/A549、D-(-)-MTX/A549耐药指数分别为6.0的和20.2。倒置相差显微镜观察细胞形态发生了改变;细胞生长曲线显示D-(-)-MTX/A549的增殖略慢于亲本细胞,而L-(+)-MTX/A549的增殖最慢;流式细胞仪检测细胞周期结果显示L-(+)-MTX/A549、D-(-)-MTX/A549耐药细胞株S期细胞数量减少(P<0.05),G0/G1期细胞增多(P<0.05);CFSE检测A549、L-(+)-MTX/A549、D-(-)-MTX/A549的MFI分别为(6.08±0.55)、(7.72±0.30)、(6.90±0.18)。两对映体细胞株间有明显手性差异。结论本研究建立了MTX两种对映体耐药细胞株,为进一步研究其耐药机制提供了一种实验模型。

表皮生长因子受体介导的信号转导与肿瘤侵袭、转移的关系研究进展

表皮生长因子受体(EGFR)属受体酪氨酸蛋白激酶,在多种肿瘤中表达或高表达。与配体结合后传递信号至细胞核内,调节基因的表达。参与生长、分化、增殖、血管发生和凋亡等多种细胞功能的调节。肿瘤的侵袭、转移是一个复杂的过程,也是导致肿瘤患者死亡的主要原因。本文就EGFR的结构、信号转导及其在肿瘤的侵袭和转移中的作用作一综述,为肿瘤的靶向治疗提供新思路。

柱上样本堆积毛细管电泳法同时检测细胞内氨甲蝶呤及其六种代谢产物

目的建立柱上堆积高效毛细管电泳法同时检测细胞内氨甲蝶呤(MTX)及其6种代谢产物氨甲蝶呤多聚谷氨酸链(MTXPG)的方法。方法采用高效毛细管电泳技术,以75 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH值7.40)作为分离介质,用水和乙腈(V/V=1∶1)作溶剂重组残留样本的方法进行柱上样本堆积,0.5 psi压力进样,进样时间50 s,在分离电压28 kV、检测波长300 nm条件下对MTX和MTXPG进行分离。在此基础上,检测细胞内MTX及其代谢产物MTXPG的含量。结果通过不断改变分离缓冲液中异丙醇(5%、8%、10%,V/V)和羟丙基-β-环糊精(hp-β-CD)浓度(20、25、30 mmol/L),发现在含8%异丙醇、25 mmol/L hp-β-CD的缓冲液条件下,30 min内实现7种组分的完全分离。用水和乙腈(V/V=1∶1)作溶剂重组残留样本进行柱上样本堆积的方法可使检测灵敏度提高10倍。结论建立柱上样本堆积高效毛细管电泳法可同时检测细胞内MTX及其代谢产物MTXPG。该方法具有高效、快速、简便、高灵敏度的特点。

聚乙烯吡咯烷酮无胶筛分毛细管电泳法分离鉴定DNA片段

目的在非涂层无胶筛分毛细管电泳中探讨一种简便快捷的分离鉴定DNA片段的新方法，以期更好的用于基因诊断。方法在非涂层无胶筛分毛细管电泳中，以聚乙烯吡咯烷酮（PVP）为筛分介质，用pUC19DNA／Mspl（HpaⅡ）标准DNA片段为实验对象，通过调节分离缓冲液中筛分介质的浓度、电泳缓冲液的pH值、运行电压及毛细管的温度，优化出分离26～501bpDNA片段的最适条件。在此条件下分离了Y染色体无精症因子（AZF）区域4个位点的多重聚合酶链反应（PCR）扩增产物。结果PVP作为筛分介质在非涂层无胶筛分毛细管电泳中对于长度〈501bp的短链除了110和111bp外均获得良好的分离效果，且迁移时间与碱基对数目呈良好线性关系。不但对多重PCR扩增产物实施了好的分离，而且依据碱基对数目与迁移时间之间的线性关系，对其大小也进行了精确的推断。结论PVP是一种良好的筛分介质，运用其进行无胶筛分毛细管电泳对于遗传性疾病的诊断将更加快速、准确、简便、灵敏。

A549/MTX对映体耐药细胞的裸鼠荷瘤模型的建立

目的利用L型和D型氨甲喋呤(MTX)对映体分别建立人肺腺癌A549细胞株裸鼠耐药模型,为进一步揭示MTX对映体体内活性差异的原因提供实验平台。方法裸鼠皮下分别接种A549、耐药细胞株A549/L-MTX、A549/D-MTX各6×106个/0.2ml,观察肿瘤生长特性;瘤体原代培养后四甲基偶氮唑兰(MTT)法检测耐药指数(resistance index RI);免疫组化(IHC)检测ki-67、多药耐药相关蛋白1(multidrug resistance-associated protein1,MRP1)、survivin变化。结果从肿瘤生长曲线上看瘤体积三者差异有统计学意义(P<0.05),A549/L-MTX/nude组体积更小。A549/L-MTX/nude移植瘤RI为4.9,为低度耐药,A549/D-MTX/nude移植瘤RI为14.5,为中度耐药。A549/L-MTX/nude相关蛋白总体表达低于A549/D-MTX/nude,两者表达差异有统计学意义(P均<0.05)。结论成功建立对MTX两种对映体耐药的A549细胞株裸鼠肿瘤模型,且两种耐药细胞具有不同耐药特性,为研究MTX对映体体内抗肿瘤活性差异提供了较好的实验平台。

检测细菌性阴道病干化学法的建立及评价

利用肉眼观察反应产物颜色的变化探讨研发试剂与酶标准品的最佳反应条件,在pH值6.2,37℃,15 min,MSTT为10μg时,研发干片与酶标准品达到最佳反应。临床实验中,将研发试剂、细菌性阴道病(BV)BLUE、国产试剂盒分别对临床标本进行对比检测,研发试剂与BV BLUE对BV的检测效果差异无统计学意义,符合率为97%。而国产A试剂盒与BV BLUE对BV的检测效果差异有统计学意义(P<0.01,χ2=0.390,r=0.42),符合率仅为67%。

BLM基因的研究进展

BLM是RecQ DNA解螺旋酶家族成员之一。RecQ DNA解螺旋酶家族在抑制人类肿瘤发生及早衰方面发挥着重要作用。本文介绍了BLM基因的结构与生物学特性,并在此基础上对BLM基因突变及其蛋白表达作一综述。

肿瘤基因启动子区异常甲基化与肿瘤的发生

肿瘤的发生和发展是一个与多基因、多步骤的致癌因素相关的复杂过程,包括了原癌基因及肿瘤抑制基因的改变、错配修复基因的突变、DNA甲基化和微卫星不稳定性。癌基因的低甲基化与抑癌基因的高甲基化在肿瘤发生、发展中的基因表达调控、基因结构的稳定等方面发挥重要作用。DNA甲基化是指生物体在DNA甲基转移酶的催化下,以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体,将甲基转移到特定碱基上的过程。甲基化异常被认为是肿瘤的一个特征,是基因组中一种重要的表观遗传修饰,与肿瘤的发生、浸润及转移相关。基因局部甲基化模式的改变已成为令人瞩目的研究领域。本文就DNA甲基化及肿瘤基因启动子区甲基化研究的相关进展作简要综述。

CML患者TGF-β1 mRNA与bcr/abl^(P210)融合基因转录本表达的关系

目的通过分析慢性粒细胞白血病(CML)患者转化生长因子-β1(TGF-β1)mRNA与bcr/abl^(P210)融合基因转录本(简称bcr/abl^(P210))的表达水平,探讨两者在CML发病过程中可能的作用。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测73例CML患者外周血和骨髓中TGF-β1 mRNA及bcr/abl^(P210)的表达水平,以22名健康体检者作为正常对照组。TGF-β1 mRNA与bcr/abl^(P210)的相关性采用Pearson相关分析。结果 CML患者骨髓和外周血样本中TGF-β1 mRNA、bcr/abl^(P210)的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。正常对照组外周血中TGF-β1 mRNA的表达水平明显高于CML患者骨髓中TGF-β1 mRNA的表达水平(P<0.05),正常对照组TGF-β1 mRNA的表达水平是CML组的11.39倍。相关性分析显示CML患者TGF-β1 mRNA与bcr/abl^(P210)呈正相关(r=0.53,P<0.01)。结论骨髓TGF-β1 mRNA有可能作为一种新的CML诊疗指标。

某三甲医院EB病毒感染的临床回顾性分析

目的探讨某三甲医院一年来EB病毒(epstein-barr virus,EBV)感染的情况,分析常见病种的构成及临床特征,为EBV感染及相关疾病的防治提供科学的理论依据。方法回顾分析该院2015年10月~2016年9月采用荧光PCR法检测EBV核酸载量,并对检测结果及患者的临床资料进行分析。结果 1 313例血浆标本中EBV脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)阳性标本314例,总体阳性检出率为23.91%,其中女性患者的阳性检出率为21.60%,男性为25.27%,男女不同性别的阳性检出率无差异(X^2=2.26,P=0.133)。在不同年龄段的EBVDNA阳性检出率出现两个高峰,分别为1~10岁和61~70岁。不同季节间的EBV阳性检出率也有不同,其中秋季最高为36.44%,冬季最低为13.00%。该院科室之间患者EBV的阳性检出率前五位的依次为:儿科(40.91%)、放疗科(39.30%)、血液科(18.50%)、感染科(16.98%)、重症加强护理病房(intensive care unit,ICU)(15.79%)。不同疾病的EBV阳性检出率不同。结论 EBV的阳性检出率与国内其他地区报道相似,有年龄、季节差异,无性别差异。EBV感染的临床表现复杂多样。

MTX对映体耐药A549细胞株中EGFR基因mRNA的表达分析

【摘要】目的探讨表皮生长因子受体（epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR）在氨甲喋呤（methotrexate，MTX）对映体L-（＋）-MTX和D-（-）-MTX耐药A549细胞株中的表达。方法采用RT-PCR方法测定肺癌A549敏感细胞株和15p,moUL、35p,mol／L、55p,mol／L的L-（＋）-MTX和D-（-）-MTXA549耐药细胞株中EGFRmRNA表达情况。结果15μmol／L、35μmol／L、55μmol／LL-（＋）-MTXA549耐药细胞株中EGFR基因表达的mRNA相对含量分别为肺癌A549敏感细胞株的（1．55±0．26）倍、（1．86±0．13）倍、（1．20~0．05）倍。RT—PCR结果显示，A549敏感细胞株和L-（＋）-MTX各浓度A549耐药株均扩增出315bp条带，有EGFR基因表达，而3种浓度的D-（-）-MTX耐药细胞株中EGFR基因不表达。结论MTX诱导耐药后A549细胞株中EGFRmRNA发生变化，且在3种浓度两种对映体细胞株间具有明显的手性差异，MTX可能通过改变EGFR基因启动子的甲基化状态，影响EGFR的表达。

BLMmRNA在白血病细胞中的表达及其临床意义

目的分析BLM基因在白血病骨髓细胞中的表达情况及其临床意义。方法收集2011年1月至12月安徽省立医院血液科住院和门诊随访的125例白血病患者骨髓标本为研究对象。其中包括59例慢性粒细胞白血病（CML），66例急性白血病（AL）。对照组为5例门诊非恶性血液病患者的骨髓标本，其中女性3例，男性2例，年龄在15岁至53岁。采用半定量逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）法检测了已通过细胞形态学和免疫分型检查骨髓细胞中BLMmRNA的表达情况，按患者年龄、性别、所患白血病类型、外周血白细胞计数情况、有无肝脾肿大、融合基因表达情况、染色体核型、是否初诊以及是否移植进行分组。回顾性分析BLM基因在各分组中的表达情况以及与以上各因素的相关性。采用，检验、单因素方差分析、t检验以及Pearson相关性检验进行统计学分析。结果BLM基因在各型白血病中均有表达。125例白血病患者骨髓标本中，BLM基因阳性表达71例，阴性表达54例，5例非恶性血液病患者的骨髓标本中均不表达。白血病患者骨髓细胞内BLM基因的表达在不同白细胞计数分组问以及融合基因分组间，差异有统计意义（矿值分别为14．730和22．399，P均〈0．05）。经治疗后的白血病患者BLM基因的表达水平（0．1788±0．1091）低于初诊（0．3276±0．2016）白血病患者，差异有统计学意义（t=3．937，P〈0．05）；移植后的患者BLM基因表达水平（0．1271±0．1009）低于未经过移植（0．2902±0．2034）的患者，差异具有统计学意义（t=2．061，P〈0．05）。Pearson相关性分析显示白血病骨髓细胞中BLM基因的表达与融合基因呈正相关（r=0．357，P〈0．01），并且与染色体核型呈正相关（r=0．279，P〈0．05）。结论BLM基因表达水平的测定可作为判断白血病患者病情严重程度和预后的指标，检测其水平可能为临床和疗效判断提供依据。

实时荧光PCR监测HBV感染患者拉米夫定治疗病毒YMDD变异

目的 建立一种快速准确的实时荧光PCR方法检测HBV感染患者经拉米夫定治疗后YMDD变异情况。方法 首先用PCR法筛选HBVDNA阳性血清157例，HBVDNA含量为2．0×10^3-8．0×10^8拷贝／ml，HBVDNA阴性血清30例，然后采用TaqMan探针技术和选择性引物的实时荧光PCR对其进行YMDD变异检测。通过变异株和对照管的循环阈值（cyclethreshold，Ct值）差来计算血清中总HBV中的YMDD变异株含量，并用PCR产物直接测序方法随机对69例HBVDNA阳性标本RT区进行基因序列分析，验证所建立方法的准确性。结果 187例接受拉米夫定治疗患者血清标本中，发生YMDD变异88例，其中YIDD变异39例，YVDD变异38例，YIDD与YVDD混合变异11例。突变株的含量为10％～100％。30例HBVDNA阴性血清的C管循环40次，69例测序结果显示68例两种方法检测结果完全相同，符合率为98．55％。结论 采用选择性引物和TaqMan探针技术建立实时荧光PCR方法能快速准确地检测YMDD变异情况，并能检测患者变异株在HBV总量中的比例，为临床使用拉米夫定治疗乙型肝炎病毒感染监测耐药性提供一种有效方法。

毛细管电泳免疫-激光诱导荧光术测定甲氨蝶呤对映体耐药A549细胞株中叶酰聚谷氨酸合成酶

目的为观察甲氨蝶呤（MTX）对映体诱导肺癌A549细胞株耐药后叶酰聚谷氨酸合成酶（folylpolyglutamate synthetase，FPGS）含量变化，建立一种用毛细管电泳免疫-激光诱导荧光术（CEIA-LIF）测定F＇PGS的方法，以便为深入探讨肿瘤耐药机制提供新的实验手段。方法实验分别选用耐药浓度为25μmol／L的L-（＋）-MTX和D-（-）-MTX肺癌A549耐药细胞株，以MTX敏感的细胞株作对照，培养获取上述3株细胞，并粗提取FPGS做CEIA-LIF和免疫印迹（WB）实验；用异硫氰酸荧光素（FITC）标记FPGS抗体，与提取的FPGS进行免疫反应；然后采用CEIA-LIF，根据不同分子量蛋白具有不同的迁移时间，分离检测标记蛋白，检测L-（＋）-MTX和D-（-）-MTX作用耐药前后3株肺癌A549细胞株中FPGS表达含量；同时用WB作对照，以评价CEIA-LIF的特异性和FPGS定量的准确性。结果CEIA-LIF分离标记FPGs抗体与免疫复合物的分离时间分别为7.1、8．9min，分离度（R）=4．5，在10min内即完成蛋白的分离和检测。经WB鉴定3株细胞液氮冻融裂解后离心提取液中组分与FIGS抗体无非特异性条带出现。CEIA-LIF测定敏感细胞株的检测下限为0．68mg／山细胞；而其检测25μmol／LL-（＋）-MTX和25μmol／LD-（-）-MTX诱导耐药细胞中FPGS的表达含量分别为对照组敏感细胞的46．59％和48．36％。结论本研究建立的CEIA-LIF检测FPGS法具有高效快速的特点，且具与WB类似的特异性；同时提高了检测的敏感度。L-（＋）-MTX和D-（-）-MTX诱导耐药后细胞株中FPGS表达含量较敏感细胞株明显减少，证明MTX耐药细胞株FPGS表达含量受损。

实时荧光定量PCR法检测MTX对映体耐药A549细胞株及白血病患者骨髓细胞中FPGSmRNA的表达

目的建立实时荧光定量PCR检测肿瘤细胞中FPGSmRNA表达的方法，研究MTX对映体[L-（＋）-MTX和D-（-）-MTX]耐药细胞株中FPGS的基因表达差异，并用于观察白血病患者MTX治疗耐药前后FPGSmRNA表达水平的变化。方法用SYBRGreenI为荧光染料，以β—actin作参照，建立检测FPGSmRNA的实时荧光定量PCR方法。根据Ct值、标准曲线相关系数、斜率、重复性曲线、熔解曲线、扩增效率曲线等进行方法学评价。并用该方法检测MTX对映体耐药细胞株及应用MTX耐药的14例白血病患者骨髓细胞中FPGSmRNA的表达。结果建立的标准曲线ct值与模板浓度有良好的线性关系，FPGS和β-actin标准曲线相关系数分别为0．9968和0．9987，斜率分别为-3．595和-3．740，批内CV为1．27％-2．95％，批间CV为3．82％；熔解曲线均呈单个特异峰，扩增效率相似（斜率为0．0217）；L．（＋）-MTX耐药细胞和D．（-）-MTX耐药细胞中FPGSmRNA相对含量分别为（3．51±0．66）和（0．16±0．01），A549亲本细胞（S）中FPGSmRNA相对含量为（1．00±0．31），差异有统计学意义（F=64．45，P〈0．01）；L-（＋）-MTX耐药细胞和D．（-）-MTX耐药细胞间FPGSmRNA相对含量差异有统计学意义（q=9．29，P〈0．01）。白血病患者应用MTX治疗耐药后，FPGSmRNA表达水平为（0．35±0．04），用药前为（1．00±0．44），差异有统计学意义（t=8．83，P〈0．01）。结论建立的实时荧光定量PCR检测FPGSmRNA的方法重复性好、特异度高，可用于FPGSmRNA含量分析。MTX诱导耐药后细胞株及白血病患者骨髓细胞中FPGSmRNA表达发生了变化，MTX2种对映体形式在细胞耐药机制中可能发挥了不同的作用。

甲氨蝶呤对映体诱导肺癌细胞耐药后引起血管内皮细胞分化差异的研究

目的研究甲氨蝶呤（MTX）对映体大剂量冲击作用肺癌A549细胞后，MTX对映体耐药细胞血管分化是否具有手性选择性。方法用大剂量冲击法诱导获得A549对映体耐药肺癌细胞，流式细胞双色分析细胞CD44／CD31以及P-170表达；皮下接种裸鼠，成瘤后取瘤体切片，进行CD34组化染色，计数新生微血管密度（MVD）。以A549亲本细胞（未获得耐药）作为对照组。结果分别建立耐药浓度为15μmol／L的L—MTX和D—MTX的A549耐药细胞株；它们与各自对映体的耐药指数分别为12．4±1．2和20．14-2．3；A549亲本细胞、L—MTX耐药细胞和D．MTX耐药细胞中：CD31’阳性率分别为55．5％±9．7％、32．9％±8．O％和91．9％±3．2％，差异有统计学意义（F=511．92，P=0．000）；P-170阳性率分别为85．5％±4．6％、71．5％±8．2％和87．0％±8．9％，L—MTX耐药细胞P-170的阳性率低于D．MTX耐药细胞（t=6．13，P=0．002）；3种细胞植入裸鼠成瘤后切片免疫标记CD34统计新生MVD，A549亲本细胞为3．6±1．2，L-MTX耐药细胞为7．24-1．7，D-MTX耐药细胞为55．9±11．9，D．MTX耐药细胞显著高于L—MTX耐药细胞（t=13．37，P=0．000）。结论MTX对映体诱导肺癌A549耐药细胞向血管内皮细胞分化能力不同，D—MTX耐药细胞经血管转移高于L．MTX耐药细胞，这提示MTX制剂中D型组分不能简单当成污染物而忽视，应尽量选用单-对映体的L-MTX药物制剂，减少D—MTX带来的副作用。

Bcl-2家族在肿瘤进展和治疗中的意义

Bcl-2家族对于线粒体途径细胞凋亡具有双重调控作用，其促凋亡蛋白与抑凋亡蛋白的比例与肿瘤形成、肿瘤耐药性的产生及预后密切相关。因此，Bcl-2家族成为肿瘤生物治疗中的重要靶点，针对Bcl-2家族的某些生物治疗手段和短肽、有机小分子等新药被开发应用于Bcl-2高表达肿瘤的治疗。

氨甲蝶呤耐药细胞内整体DNA甲基化水平检测方法的建立及其应用

目的建立一种简便快速检测细胞内整体DNA甲基化水平的方法，以用于临床甲基化诊断。方法采用高效毛细管电泳技术，以pH9．6的48mmol／L碳酸氢钠溶液[含60mmoL／L十二烷基硫酸钠（SDS）]为分离缓冲液，检测波长为256nm，在20kV电压下，0．7psi压力进样时间5s，对2’-脱氧胞苷（dC）、5-甲基-2’-脱氧胞苷（mdC）、2’-脱氧腺苷（dA）、2’-脱氧胸苷（dT）、2’-脱氧鸟苷（dG）5种物质进行分离。在此基础上检测氨甲蝶呤（MTX）诱导的肺癌A549耐药细胞株内整体DNA甲基化水平。结果通过不断优化分离缓冲液中SDS浓度（40、60、80mmol／L）、pH值（9．4、9．6、9．8）、分离电压（15、17、19、20、22kV）、进样时间（5、10、15、20、30S）和毛细管温度（15、20、25、30℃），建立高效毛细管电泳检测细胞内整体DNA甲基化水平的方法，可在10min内实现dC、mdC、dA、dT、dG的完全分离，其日内变异系数（CV）〈0．2％，日间CV〈2％，最低检出限为2μmol／L。检测肺癌A549亲本细胞甲基化水平为（4．80±0．52）％；而不同浓度（15、30、40μmol／L）MTX诱导耐药A549细胞株的甲基化水平分别为（4．20±0．44）％、（3．70±0．36）％、（3．10±0．35）％。结论建立高效毛细管电泳检测整体DNA甲基化水平的方法具有高效、快速、简单、灵敏的特点；MTX耐药细胞株内整体DNA甲基化水平随着耐药浓度的增加明显降低。